TGF�拨�1、TGF�拨翿1、Smad4在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其相互關(guān)系

【摘要】  　　目的：探討TGF�拨�1、TGF�拨翿1及Smad4三者在乳腺癌中的表達(dá)與其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為以及預(yù)后的關(guān)系，為乳腺癌發(fā)病和治療機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：提取30例乳腺癌臨床標(biāo)本（經(jīng)液氮、研磨等處理）和MCF��7、T47D、SKBR��3三種乳腺癌細(xì)胞（取指數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞）總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈，克隆TGF�拨翿1、Smad4基因片段，測(cè)定質(zhì)粒濃度，制備標(biāo)準(zhǔn)樣品，并作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，探針?lè)�熒光定量PCR（FQ�睵CR）檢測(cè)TGF�拨翿1和Smad4基因mRNA表達(dá)。結(jié)果：FQ�睵CR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)惡性程度高的SKBR��3細(xì)胞，其TGF�拨翿1和Smad4的基因拷貝數(shù)明顯低于惡性程度低的MCF��7細(xì)胞（P均＜0.01），T47細(xì)胞兩種基因拷貝數(shù)介于兩者之間。結(jié)論：隨著乳腺癌細(xì)胞病理類型惡性程度增加，TGF�拨翿1和Smad4 mRNA表達(dá)逐步下降，表明TGF�拨�1和Smad4可能具有類似乳腺癌抑癌基因的作用。

【關(guān)鍵詞】  轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1; 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1受體; Smad4; 乳腺癌

　　［ABSTRACT］ Objective: To investigate the expression of TGF�拨�1, TGF�拨翿1 and Amad4 proteins and the relationship to the initiation, progression, metaptosis and prognosis of breast cancer. Methods: The samples of 30 cases and 3 cell lines(MCF��7,T47D,SKBR��3) of breast cancer were selected, and the total mRNA was extracted. Reverse transcription, and TGF�拨翿1 and Smad4 genes cloning were carried out. Then the concentration of plasmid was measured, standard curve was made, and the expression of TGF�拨翿1 and Smad4 mRNAs were assayed by FQ�睵CR machine. Results: The gene copies of TGF�拨翿1 and Smad4 in SKBR��3 cells were lower than that in MCF��7 cells (P＜0.01) and the gene copies in T47 was middle. Conclusions: Our studies by FQ�睵CR show that the lower TGF�拨翿1 and Smad4 mRNAs expression, the worse biology characteristic of breast cancer, which indicate TGF�拨翿1 and Smad4 act possibly as the role of anti�瞣ncogene in breast cancer.
   
　　［KEY WORDS］ TGF�拨�1; TGF�拨翿1; Smad4; Breast cancer

　　乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬(wàn)婦女患乳腺癌。目前，乳腺癌病因尚不十分清楚，發(fā)病機(jī)理非常復(fù)雜，涉及多個(gè)因素的作用。多數(shù)研究認(rèn)為，乳腺癌的發(fā)生是因?yàn)樵�癌基因的激活和抑癌基因的功能喪失，其發(fā)展是一個(gè)多因素多階段的過(guò)程，往往涉及多個(gè)基因的改變［1,2］。TGF�� β /Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路及其與腫瘤關(guān)系多見于胰腺癌、婦科腫瘤等［3,4］，而在乳腺癌中TGF�拨�1、TGF�拨翿1及Smad4三者的表達(dá)及其相互關(guān)系如何，它們對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展有何意義，目前還不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)擬采用熒光定量PCR (fluorescent quantitation polymerase chain reaction，F(xiàn)Q�睵CR)、免疫組織化學(xué)/免疫細(xì)胞化學(xué)、Western Blotting等技術(shù)，檢測(cè)乳腺癌患者和乳腺癌細(xì)胞株中的TGF�拨�1、TGF�拨翿1和Smad4 在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)，進(jìn)一步深入三者在乳腺癌中的表達(dá)與其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為以及預(yù)后的關(guān)系，為探討TGF�拨滦盘�(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程提供新的思路，同時(shí)為乳腺癌的Smad4基因?qū)�入治療，以及嘗試應(yīng)用iRNA技術(shù)，提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)

　　1  材料與方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  標(biāo)本和細(xì)胞 發(fā)表醫(yī)學(xué)論文

　　本組乳腺癌臨床標(biāo)本共30例，全部為海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2005年1月～2008年12月門診或住院患者，其中外科手術(shù)切除標(biāo)本25例，病理活檢標(biāo)本5例。患者年齡24～60歲，中位年齡43歲；按照病理學(xué)類型分為非浸潤(rùn)性癌4例、早期浸潤(rùn)性癌6及浸潤(rùn)性癌20例。
   
　　乳腺癌細(xì)胞株MCF��7、T47D、SKBR��3細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。正常對(duì)照：選取非乳腺癌患者正常乳腺組織手術(shù)切除標(biāo)本10例作為對(duì)照。

　　1.1.2  質(zhì)粒和細(xì)菌

　　pGEM�睺�睺GFβR1 、pGEM�睺�睸mad4質(zhì)粒構(gòu)建按照pGEM�睺 載體試劑盒（公司）的說(shuō)明。大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。

　　1.1.3  引物和探針

　　以Genebank中Smad4 和TGF�拨翿1基因 的mRNA序列作參考，各設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一條探針。⑴Smad4  上游引物(P1)：5′�睪TCGAAAACAACGCTATTGACT��3′； 下游引物(P2)：5′�睠AGAGAATTGTCGCCGTACAT��3′； 熒光探針：5′�睺CAGGACGCGATACCTCGGTATACC��3′。 ⑵TGF�拨翿1上游引物(P1)：5′�睪AACGACAACGATTCAACT��3′； 下游引物（P2）：5′�睪CAACACGATCATGACTT��3′； 熒光探針為5′�睺CTACGTAATAGCATGCGCCAAAT��3′。
   
　　探針5′端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)均為FAM，3′端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)均為TAMRA。引物及探針均由英俊公司合成。

　　1.1.4  主要試劑

　　RPMI��1640培養(yǎng)基（GIBCO BRL公司）；無(wú)支原體胎牛血清（杭州四季青公司）；HEPES粉（ASBC進(jìn)口分裝）；PBS緩沖液（NaCl 8.0g, Na2HPO4·12H2O 3.63g, KH2PO4 0.2g, pH7.4，自配）；胰蛋白酶（Sigma公司）；EDTA（公司）；TRIzol Reagent（Invitrogen公司）；DEPC（威佳公司）；氯仿（國(guó)產(chǎn)）；異丙醇（國(guó)產(chǎn)）；RT試劑盒（Fermentas公司）；Taq 酶（Progema公司）；DNA Marker（威佳公司）；Gel Estration Kit和小量質(zhì)粒抽提試劑盒（QIAGEN公司）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒（博彩生物公司）。

　　1.1.5  儀器

　　二氧化碳孵箱（Hereaus B5060EK/CO2）； 倒置相差生物顯微鏡（Olympus公司）； 紫外/可見光分光光度計(jì)（Beckman DU530）； 熒光定量PCR 儀（ABI公司）； 數(shù)顯調(diào)速多用振蕩器（江蘇金壇榮華儀器制造有限公司）； 臺(tái)