細(xì)粒棘球絳蟲成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建及鑒定

【摘要】  　　目的：構(gòu)建細(xì)粒棘球絳蟲（E.g.）成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫，并檢測文庫質(zhì)量。方法:提取E.g.成蟲mRNA，應(yīng)用SMART方法構(gòu)建pBluescript II SK全長cDNA質(zhì)粒文庫，檢測文庫的重組率及容量；用載體克隆位點(diǎn)兩端的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測插入片段大小。隨機(jī)挑選陽性重組克隆5′端測序，歸并unigene，計算unigene得率，全長性判定主要根據(jù)同源全長基因5'末端進(jìn)行比較判定并計算全長率。結(jié)果:成功構(gòu)建E.g.成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫。文庫的重組率為95.04%，庫容量1.13×106；平均插入片段長度約為1.2kb。24個隨機(jī)陽性克隆測序，unigene比例為69.57%，全長性比率為64.71％。結(jié)論:成功構(gòu)建E.g.成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫，文庫質(zhì)量良好。

【關(guān)鍵詞】  細(xì)粒棘球絳蟲；成蟲；全長cDNA質(zhì)粒文庫；構(gòu)建；鑒定

　　［ABSTRACT］ Objective: To construct and eva luate full�睱ength cDNA library of adult Echinococcus granulosus（E.g.）. Methods:mRNA was extracted from the adult E.g. and used for the construction of full�瞝ength cDNA library using SMART�瞤BluescriptⅡSK kit. The recombination rate and capability of the library was measured and the length of insert fraction of the positive recombinant clones was tested by PCR. Positive recombinant clones were randomly selected for 5'end sequencing and the rates of unigene, full�瞝ength cDNA was analyzed by EST data using bioinformatics. Results: The full�瞝ength cDNA libray of adult E.g. was constructed successfully.The recombination rate and capability of the library were 95.04% and 1.13×106, respectively.The average length of insert fraction was about 1.2kb. 24 recombinant clones randomly selected were sequenced, the rate of unigene and full�瞝ength cDNA were 69.57% and 64.71%. Conclusions: A high�瞦uality of full�瞝ength cDNA plasmid library of adult E.g. has been constructed successfully.科學(xué)論文發(fā)表 
   
　　［KEY WORDS］ Echinococcus granulosus;Adult; Full�瞝ength cDNA plasmid library; Construction; eva luation

　　細(xì)粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus，E.g.）成蟲寄生于犬科動物小腸，其中絳期幼蟲細(xì)粒棘球蚴（包蟲，echinococcus cyst/hydatid cyst）寄生在中間宿主偶蹄類家畜（羊、牛、馬等）及人的多種器官、組織內(nèi)，引起以占位性病變?yōu)橹饕�臨床表現(xiàn)的囊型包蟲病（cystic echinococcosis，CE），是一種嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)的人畜共患寄生蟲病。CE分布于世界許多國家的牧區(qū)，我國是CE的主要流行區(qū)之一，主要分布于西北牧區(qū)。CE是我國乃至世界一個重要的公共衛(wèi)生及經(jīng)濟(jì)問題［1］，已被列入我國十一五重大寄生蟲病防治項目。疫苗及早期診斷是其防治的關(guān)鍵，目前尚無成熟的疫苗及診斷試劑。該蟲的基因組學(xué)及功能基因組學(xué)尚未開展，已知基因甚少，不利于對相關(guān)基礎(chǔ)問題的研究，更不利于相關(guān)疫苗、診斷試劑及藥物的研究。
   
　　本研究目的在于通過構(gòu)建E.g.成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫并對文庫質(zhì)量進(jìn)行鑒定，為大規(guī)模表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）測序，開展基因表達(dá)譜分析，克隆和鑒定一批功能基因全長cDNA序列，并為開展重要基因的功能研究打下基礎(chǔ)。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料與試劑
   
　　E.g.成蟲標(biāo)本采自青海省西寧市人工感染犬小腸，用滅菌生理鹽水漂洗3次后液氮凍存。試劑：Trizol 總RNA提取試劑盒、1 kb DNA 梯度標(biāo)記物 為GIBCO BRL公司產(chǎn)品；SMART IV 寡核苷酸，CDS III/3JPCR 引物，pBluescript II SK的改造載體（將EcoR I和Not I之間的序列改造為Sfi I A和Sfi I B接頭序列），由上海聯(lián)合基因公司合成和提供；DH��5α感受態(tài)菌，通用合成引物M13+/M13�玻�異丙基�拨陋睤�擦虼�半乳糖苷（IPTG）和x�瞘al為上海生工生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒，荷蘭QIAGEN公司產(chǎn)品；DYEnamicTM ET DYE Terminator Kit（MegaBACETM）為美國Amersham Biosciences產(chǎn)品；Milli�睶水純化系統(tǒng)，美國Millipore公司產(chǎn)品；SpectraMax Plus384連續(xù)波長酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司產(chǎn)品；FR��280電泳儀，上海復(fù)日公司產(chǎn)品；HYBAID PCR EXPRESS PCR儀，英國Thermo Hybaid公司產(chǎn)品；ABI PRISM 3700測序儀，美國PE ABI公司產(chǎn)品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  全長cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建

　　1.2.1.1  樣品總RNA抽提及mRNA純化

　　按提取試劑盒操作說明書抽提總RNA產(chǎn)物，于260nm及280nm測吸光度（A260及A280），計算A260/A280比值判定純度（純RNA A260/ A280=1.9-2.1），1.1%瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。
   
　　根據(jù)QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits操作說明書進(jìn)行分離，A260及A280檢測及1.1%瓊脂糖電泳檢測抽提結(jié)果。

　　1.2.1.2  cDNA第一鏈合成

　　0.5mL滅菌離心管中加入以下試劑： 2μg 樣品 RNA，1μL SMART IV Oligonucleotide，1 μLCDS III/3' PCR Primer，加水補(bǔ)足5μL，混勻試劑并稍離心，72℃溫浴2min，冰浴2min，稍離心后加入下列試劑：2.0μL 5×First�睸trand Buffer，1.0μL DTT (20mmol/L)，1.0μL dNTP Mix (10mmol/L)，1.0μL PowerScript Reverse Transcriptase，總反應(yīng)體系