乙型肝炎病毒X基因對肝癌細胞Bel��7404細胞周期的影響

【摘要】  目的：構建轉基因細胞株Bel��7404/HBx,研究HBx對肝癌細胞周期及凋亡的影響，為探索HBx與原發性肝細胞癌（HCC）之間的關系提供更為完善的理論依據。方法：運用脂質體轉染及G418篩選獲取Bel��7404/HBx陽性克隆，并分別用聚合酶鏈反應（RT�睵CR）和Western�瞓lot鑒定HBx mRNA與蛋白的表達，進一步用四唑蘭比色實驗（MTT）檢測Bel��7404/HBx的增殖，流式細胞儀（FCM）檢測Bel��7404/HBx的細胞周期及凋亡。結果：成功構建Bel��7404/HBx，MTT檢測結果表明Bel��7404 /HBx生長速度加快，流式細胞儀檢測結果顯示,與對照組細胞相比, Bel��7404 /HBx凋亡率明顯降低（P<0.05)，G1期細胞比例降低（P<0.05), S期及G2期細胞所占比例增高（P<0.05)。結論:HBx能加速細胞周期進程，從而促進肝癌細胞的生長并抑制細胞凋亡，可能對肝癌細胞惡性程度具有重要的影響。

【關鍵詞】  HBx；原發性肝細胞癌；聚合酶鏈反應；免疫印跡；四唑蘭比色實驗；流式細胞術
  

［ABSTRACT］ Objective: To establish transgenic cell lines Bel��7404/HBx, study the influence of HBx on cell cycles and apoptosis, and provide more extensive theories for exploring the relationship between HBx and hepatocellular carcinoma (HCC). Methods: The Bel��7404/HBx positive clones were obtained by Lipofectamine tranfection and G418 selection, then HBx mRNA and protein were detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT�睵CR) and Western blot, respectively. The tetrazolium blue colorimetric test (MTT) and flow cytometer ( FCM) were used to measure proliferation, cell cycles and apoptosis of Bel ��7404/HBx. Results: Bel��7404/HBx was successfully established. MTT showed that the Bel��7404 / HBx grew faster than the control group （P<0.05), and FCM showed that compared with cells in control group, the apotosis rates of Bel��7404/HBx were at a low level, cells in G1 phase decreased but increased in S and G2 phase in proportion（P<0.05). Conclusions: HBx can accelerate cell cycle progression to promote the growth of hepatoma cells but inhibit apoptosis, which indicates that it may have great influence on the malignant degree of hepatocellular carcinoma.

   
［KEY WORDS］ HBx; Hepatocellular carcinoma; RT�睵CR; Western blot; MTT; FCM

    原發性肝細胞癌(HCC)一直以來是危害人民身心健康的一大疾病，其發病機理多種多樣，其中HBV在其發病中一直占據重要的地位。目前研究證實，HBV中最小的閱讀框X基因在HCC發生中所起的作用至關重要，但各家研究結論不太一致，有的結論甚至互為矛盾，這也使得HBx致癌機理尚未研究清楚。因而，HBx致HCC機理仍然是目前研究的熱點，為此，我們以重組質粒pcDNA3.1 (＋) /v5�瞙isB�睭Bx作為載體，通過脂質體轉染將X基因導入肝癌細胞Bel��7404細胞系中，用G418篩選獲取穩定表達HBx蛋白的陽性克隆，并觀察HBx對肝癌細胞Bel��7404增殖、凋亡及細胞周期的影響，為進一步探索HBx與HCC之間的關系提供更為完善的理論依據，希望能為肝細胞癌的預防、診斷及治療提供新的策略。

1  材料與方法

1.1  材料體育論文發表

   
Effectene Transfection Reagent（Qiagen）；G418（Promega）；各種限制性核酸內切酶、聚合酶等（Takara）；鼠單克隆抗體（ABCam）；羊抗鼠IgG(晶美)；DMEM 、MTT及PI(sigma)。重組質粒 pcDNA3.1（＋）/v5�瞙isB�睭Bx由上海第二軍醫大學遺傳研究所何曉文教授惠贈；DH5α由西班牙Navarra大學癌癥基因研究所錢程教授提供；Bel��7404細胞由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所劉新垣院士惠贈。擴增HBx基因片段上游引物為：5′�� CGGAATTCCGATGGCTGCTAGGCTGTG��3′,命名為P1,下游引物為：5′�睠CCTCGAGGGTGCATGGTGCTGGTGA��3′,命名為P2，擴增目的片段為445bp,PCR引物合成及測序由上海英駿生物技術有限公司完成。

1.2  方法

1.2.1  Bel��7404細胞的轉染與篩選  重組質粒 pcDNA3.1（＋）/v5�瞙isB�睭Bx經酶切、PCR及測序鑒定后按Effectene Transfection Reagent說明書進行轉染操作，48h后用含500mg/L G418的選擇培養基篩選陽性克隆。篩選至對照組細胞全部死亡后實驗組存活的細胞即為陽性克隆，挑取克隆擴大培養并將G418濃度減至250mg/L維持篩選，以獲得穩定表達HBx的轉基因細胞株（Bel��7404/HBx）。實驗設空白對照組（Bel��7404細胞）與空載體對照組（轉染pcDNA3.1的Bel��7404細胞，Bel��7404/ pcDNA3.1）。以下所設對照組與此相同。

1.2.2  轉基因細胞株Bel��7404/HBx的鑒定  采用聚合酶鏈反應（RT�睵CR）檢測HBx mRNA的表達: TRIzol一步法提取各組細胞總RNA（按試劑盒說明書操作），經逆轉錄生成cDNA，取2μL cDNA作模板，以上述引物擴增HBx基因片段，條件如下：94℃預變性10min，94℃變性45s，52℃退火1min，72℃延伸1min，擴增30個循環，2%瓊脂糖凝膠電泳后成像觀察。Western blot檢測HBx 蛋白的表達:各組細胞培養48h后置冰上PBS洗滌2次，加入冰預