褪黑素對Aβ誘導的大鼠腦組織GFAP和S100β蛋白表達的干預作用

【摘要】  目的 觀察褪黑素(MT)干預β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導的大鼠腦組織膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和S100β蛋白的表達，探討MT對老年癡呆癥(AD)治療的作用機制。方法 30只大鼠隨機分為生理鹽水對照組、β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導AD模型構建組(模型組)和AD模型+MT治療組(MT組)。動物喂養40 d時取大鼠腦組織，用HE染色觀察腦組織病理變化，免疫組化染色法檢測Aβ標記的腦組織部位以及Aβ對神經細胞毒性作用，同時檢測膠質細胞的GFAP和S100�拨碌鞍椎谋磉_水平。結果 HE染色觀察腦組織病變在MT組明顯輕于模型組;免疫組化結果顯示，Aβ的表達水平在模型組和MT組二者間無明顯差異，但Aβ對海馬CA3區神經元損傷作用在模型組要大于MT組。GFAP和S100β表達水平在模型組則顯著高于MT組和正常組(P<0.05)。結論 用MT干預治療，可降低AD模型鼠膠質細胞表達GFAP和S100β蛋白的水平，從而起到了減輕大腦神經元細胞的損傷作用。

【關鍵詞】  褪黑素; 老年癡呆癥;β�驳矸蹣拥鞍�;星形膠質細胞

　 阿爾茨海默病(AD)是一種常見的老年癡呆癥，主要表現為認知能力喪失以及神經病理性結構損傷,包括腦組織萎縮、老年斑和神經纖維纏結與大量的β�驳矸蹣拥鞍�(Aβ)沉積。AD是威脅老年群體健康與壽命的最重要的疾病之一〔1〕，目前尚無有效治療方法，因此深入開展對AD發病機制研究和尋找有效治療方法具有重要意義。研究證明年齡老化和腦組織中Aβ沉積是促使AD發生發展的主要原因，與機體氧自由基產生增加、清除氧自由基能力下降等因素有關〔2〕。神經膠質細胞構成中樞神經系統微環境，活化后可分泌大量細胞因子，釋放氧自由基、激活補體，啟動免疫反應，在AD的病變中起重要作用。褪黑素(MT)是一種重要的抗衰老激素，可有效地防止大腦功能退化，減少與年齡相關的炎癥基因表達增長，并誘導抗氧化的基因生成;能通過血腦屏障，且價廉又無明顯毒副作用〔3〕。考慮到MT具有巨大的潛在效應，故有可能成為一種極好的用于研究治療AD疾病的化合物。本實驗在觀察Aβ所引起神經毒作用的同時，重點探索MT干預Aβ誘導大鼠腦組織表達GFAP和S100β兩種蛋白水平的影響，以了解MT在Aβ沉積在腦組織所發揮的作用，為治療AD提供實驗依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 纖維型Aβ1～42的制備 取0.5 g Aβ1～42(美國Sigma公司)溶于250 μl注射用生理鹽水中，用電動混懸器充分混勻，置于37℃恒溫箱中孵育1 w，使其成為聚集狀態的纖維型Aβ1～42,置4℃冰箱中備用。

　　1.2 動物分組及模型制備 成年SD雄性大鼠30只，體重180～220 g,由中南大學湘雅醫學院實驗動物中心提供，其中隨機取20只建立AD模型，10只作為正常對照組。建模方法：將SD大鼠用10%水合氯醛 (0.35 mg/kg)麻醉后置于立體定位儀上，切開皮膚，找到前囟所在位置，參考大鼠圖譜確定前囟后3.0 mm，中線旁2.0 mm為海馬的所在的體表投影位置，以牙科鉆鉆開一骨窗，將微量注射器固定在立體定位儀上，進針約2.8 mm，緩慢均勻注入纖維型Aβ1～42溶液10 μg/5 μl,5 min注射完畢，留針5 min，然后緩慢撤針，術后縫合皮膚。對照組按照模型制備的全過程在腦內注射生理鹽水5 μ1。建模成功后隨機分為模型組和MT用藥組，與正常組均平行給予常規飲食及正常活動。模型組和對照組均灌胃1 ml生理鹽水，MT用藥組用褪黑素0.15 mg/kg(生理鹽水配制)灌胃，每次1 ml/d，持續40 d。論文代理發表

　　1.3 腦組織切片的制備 模型建立40 d后，將對照組、MT組和模型組三組大鼠用10%水合氯醛(0.35 mg/kg)麻醉，暴露心臟，經左心室灌注0.01 mol/L PBS，待大鼠的肝臟顏色變淺，然后改以4%的多聚甲醛灌注，流速約為10 ml/min，并取腦組織置于4%多聚甲醛溶液中冰箱后固定過夜，次日用0.01 mol/L PBS反復浸洗，最后將腦組織梯度酒精脫水，透明，石蠟包埋，冠狀切片(厚約5 μm)備用。

　　1.4 免疫組織化學主要試劑和實驗方法 取脫蠟切片入PBS緩沖液，經抗原修復液(美國Vector，H��3300)80℃存放20 min，待自然冷卻后，緩沖液清洗2次，再入3% H2O2室溫下5 min，以消除內源性過氧化物酶。然后，切片孵育在2%小牛血清中1 h，以減少組織非特異性反應。實驗中所用抗體6E10購于美國Covance 公司(產品編號：SIG��39340，1∶1 000);NeuN購于Chemicon公司(產品編號：MAB��377，1∶1 000);S100�拨沦徲赟igma，產品編號：S2657，1∶100),GFAP購于美國DAKO公司(Z0334，1∶1 000)。切片分別在 1%小牛血清與0.1% Triton和上述抗體的混合液中4℃冰箱孵育過夜，次日經緩沖液洗滌3次后,加相應二抗(1∶400)溶液，室溫孵育1 h，緩沖液洗滌3次后，加生物素與卵白素結合(ABC)試劑盒配置的混合液中再孵育1 h。底物呈色反應采用DAB試劑盒。所有二抗、ABC和DAB試劑盒均購自美國Vector公司。呈色反應后，切片經逐級脫水并用加拿大中性樹膠封片。

　　1.5 圖像采集及統計學分析 在日本產Nikon Eclipse 80i顯微鏡下觀察結果，并用Nikon DS高分辨率數碼相機經NIS�睧lements AR 3.0軟件拍照。對腦組織切片均通過拍照收集皮質和海馬切面圖像。結果分析，采用Ver.3.00程序軟件作圖像數字采集及半定量分析。結果評估采用單一方差分析，Excel軟件統計制表。

　　2 結 果

　　2.1 Aβ在模型組和MT組腦組織的表達 6E10(Aβ1～16)抗體標記腦組織的溶解或聚集狀態Aβ。顯微鏡下觀察在對照組未發現Aβ的沉積，而模型組和MT組可見海馬中央以及皮質中線旁2 mm處可見有大小不等分布不均的6E10抗體陽性反應物表達，兩組比較沒有明顯的差異,見圖1。

　2.2 MT對Aβ的神經細胞毒性影響 在模型組和MT組的Aβ注射的腦組織皮質區和海馬CA3區可見神經細胞大小不一，部分神經細胞萎縮變形，神經細胞帶受損，細胞數量減少，對照組未發現上述改變，見圖2。發表論文網

　　圖1 Aβ在各組腦組織的表達(DAB，×100)圖2 MT對Aβ的神經細胞毒性影響(DAB，×400)

　　2.3 各組大鼠腦組織GFAP與S100�拨碌鞍椎谋磉_ GFAP和S100β蛋白在各組大鼠腦組織均有表達，GFAP在對照組的陽性反應細胞數量較少，細胞染色較淺，MT和模型組兩種蛋白的陽性反應細胞增多，染色反應增強，腦組織海馬和皮質部位均有明顯的表達，兩組反應與對照組相比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1,圖3，圖4。表1 各組大鼠腦組織中6E10、GFAP和S��100 β表達(x±s)

　　3 討 論

　　已知腦內發揮神經毒作用的Aβ主要是Aβ1～40和Aβ1～42。雖然實驗用Aβ是人工合成，但不少研究證明它幾乎和內生性的Aβ1～42有同等毒性作用，以聚集狀態的Aβ誘導的神經元退行性病變與AD的病理改變十分相似〔4〕。本實驗通過以纖維型Aβ進行大鼠背側細胞帶微量注射，Aβ1～42以不溶解狀態成大分子而不被吸收，用免疫組織化學的方法用6E10抗體反應證實Aβ存在模型鼠大腦皮質