熊果酸對卵巢癌細胞黏附、運動和侵襲的影響

【摘要】  目的 探討熊果酸(UA)對人高轉移卵巢癌細胞HO��8910黏附、運動和侵襲的影響。方法 以不同濃度的UA處理高轉移卵巢癌細胞HO��8910，采用MTT法及細胞黏附人工重組基底膜實驗檢測UA對HO��8910細胞的細胞毒作用及黏附能力的影響;Transwell小室法檢測UA對HO��8910細胞侵襲能力和趨化運動能力的影響。結果 不同濃度UA處理后，隨著UA濃度從10 μmol/L增加到30 μmol/L，與對照組比較，對細胞黏附抑制率增強(P<0.01)，能顯著降低HO��8910運動能力和侵襲能力(P<0.01)。結論 UA能抑制卵巢癌細胞HO��8910黏附、運動和侵襲能力。

【關鍵詞】  熊果酸;卵巢癌;侵襲

　　 熊果酸(UA)，屬于五環三萜類化合物，研究表明具有抗炎、護肝、降血脂等多種生物學活性。近年來研究發現UA具有多種抗腫瘤的作用〔1～3〕，但其是否通過抑制腫瘤侵襲轉移起抗腫瘤作用還未見報道，本研究旨在通過體外實驗探討UA對卵巢腫瘤細胞侵襲轉移的影響和機制。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料 人卵巢癌細胞株HO��8910引自哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院研究所;UA、二甲基亞砜(DMSO )購自Sigma公司;RPMI��1640培養基、四甲基偶氮唑藍(MTT)、新生牛血清、胰蛋白酶購自杭州四季青生物工程公司;Transwell小室購自Costar公司;纖黏連蛋白購自Promega公司;Matrigel購自Becton Dickinson公司。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 細胞培養 細胞在含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI��1640的培養液中，37℃、5%CO2孵箱中，細胞經過消化傳代，取對數生長期細胞待用。

　　1.2.2 增殖抑制實驗 取對數生長期的HO��8910細胞，細胞以1×106/孔接種于96孔培養板中。將培養板放入37℃、5% CO2孵箱中培養。待細胞貼壁后取出培養板，加入不同濃度UA，使其濃度分別為10、20、30、40、50 μmol/L，每個濃度設3個平行;同時設置空白對照組。培養板放回孵箱繼續培養48 h，取出培養板，每孔加入MTT，培養板再放回孵箱孵育4 h。吸出上清液，加入200 μl二甲基亞砜。用酶標儀測570 nm 波長處每孔的吸光度(A)值。計算增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(對照組A值一處理組A值)/對照組A值×100%。

　　1.2.3 細胞黏附實驗 取96孔細胞培養板，每孔加入無血清RPMI��1640 稀釋的Matrigel 膠溶液25 μl，37℃孵箱過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，室溫干燥1 h。每孔加入2%牛血清白蛋白(BSA)20 μl，置37℃孵箱1 h，PBS 沖洗2次，室溫干燥1 h。收集對數生長期的HO��8910細胞，懸浮于含0.1% BSA�睷PMI 1640培養基中，終濃度為6×108/L。用不同濃度UA預處理細胞24 h，使其終濃度分別為10、20、30 μmol/L，每孔加入預處理細胞100 μl，對照組加入等量的PBS，置孵箱內1 h，棄去未黏附的細胞，MTT法測570 nm處測A值。每組設3個平行孔，實驗重復3次。按下式計算細胞黏附抑制率。 細胞黏附抑制率=(1-給藥組A 值/對照組A值)×100%。

　　1.2.4 細胞侵襲實驗 細胞侵襲重建基底膜實驗在Transwell小室中進行。在小室的聚碳酸濾膜PVPF膜的外表面涂趨化劑5 μg纖黏連蛋白，在膜的內表面涂5 μg Matrigel。在24孔板內加入0.1% BSA�睷PMI 1640，每孔600 μl。收集對數生長期的HO��8910細胞，懸浮于含0.1% BSA�睷PMI 1640培養基中，終濃度為1×109/L。將Transwell小室浸于24孔板的條件培養基中，每個小室加細胞懸液100 μl，再分別加入不同濃度UA，其濃度分別為10、20、30 μmol/L，對照組加入等量的PBS。37℃，5% CO2溫箱培養24 h。用棉簽擦盡膜的內表面未穿過膜的細胞。隨機選擇5個400倍顯微視野，統計視野中侵襲至濾膜下表面的細胞數目，計算平均值。按下式計算藥物對腫瘤細胞侵襲的抑制率：抑制率=對照組平均侵襲細胞數-給藥組平均侵襲細胞數/對照組平均侵襲細胞數×100%。
1.2.5 細胞運動實驗 聚碳酸濾膜內表面不鋪Matrigel,其余操作同細胞侵襲實驗。按下式計算藥物對腫瘤細胞運動能力的抑制率：抑制率=對照組平均細胞數-給藥組平均細胞數/對照組平均細胞數×100%。

　　1.3 統計學處理 數據用x±s表示，組間比較采用方差分析和SNK�瞦檢驗。

　　2 結 果醫學核心期刊論文發表

　　2.1 UA對卵巢癌細胞株HO��8910細胞生長的抑制作用 MTT法結果表明，40、50 μmol/L UA處理細胞24 h及20～50 μmol/L UA處理細胞36、48 h后，明顯抑制HO��8910細胞的增殖(P<0.05;P<0.01)。10、20、30 μmol/L UA作用24 h，對HO��8910細胞的增殖的抑制作用無顯著差異(P>0.05)，見表1。

　　2.2 UA對卵巢癌細胞株HO��8910黏附能力的影響 10，20，30 μmol/L UA作用細胞24 h時，HO8910黏附能力分別為0.389±0.074，0.371±0.043和0.312±0.011，均顯著低于空白對照組(0.695±0.127)(P<0.01)，10，20，30 μmol/L UA組表1 UA對卵巢癌細胞株HO��8910細胞的生長抑制作用(x±s)

　　2.3 UA對卵巢癌細胞株HO��8910侵襲能力和運動能力的影響 結果如表2，圖1所示，不同濃度的熊果酸在體外作用24 h后可以顯著抑制HO��8910細胞的侵襲和細胞體外趨化運動能力，實驗組與對照組比較具有顯著性差異(P<0.01) 。表2 UA對卵巢癌細胞株HO��8910侵襲能力和趨化運動能力的影響(x±s)

　　3 討 論

　　卵巢癌是女性三大惡性腫瘤之一，盡管采用了腫瘤細胞減滅術和多種化療方案，但其5年生存率依然無明顯改善。惡性腫瘤的侵襲、轉移是引起腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因，腫瘤細胞首先通過膜表面受體黏附于由細胞間質與基底膜組成細胞外基質(ECM) 成分纖維黏連蛋白、層黏連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白上，然后以蛋白酶降解基底膜和基質，最后定向運動穿越ECM 破損處，侵入局部血管、淋巴管，最終在遠離腫瘤原發生長部位的器官內形成新侵襲、轉移灶。阻斷腫瘤細胞的侵襲、轉移是腫瘤治療的主要途徑。目前雖有一些抗腫瘤侵襲和轉移的藥物在臨床上應用， 但效果不理想。中學物理論文發表

　　如何阻斷腫瘤細胞的侵襲、轉移，是目前治療腫瘤的熱點之一。UA廣泛存在于熊果、白花蛇舌草、女貞子、烏梅等天然植物和草藥中。研究表明，UA既能誘導腫瘤細胞凋亡，又能抑制正常細胞的惡變，還能干擾DNA 合成相關的酶;也可以通過堿性神經脂酶介導的caspase 3，8，9 的激活來抑制細胞增殖，并能誘導其凋亡〔4，5〕。UA還可以抑制腫瘤血管形成、抗侵襲及增強免疫功能等多種機制來抑制腫瘤的生長和擴散。本實驗觀察不同濃度UA處理24 h后，HO��8910細胞侵襲力、趨化運動及細胞黏附率，結果顯示，隨著UA濃度的增加，HO��8910細胞穿膜細胞數和細胞黏附明顯下降，表明UA能有效抑制