喹硫平對小鼠腦缺血后膠質增生及IL��1β表達的影響及其作用機制

【摘要】  目的 研究喹硫平對小鼠腦缺血后膠質增生及白介素(IL)��1β表達的影響及其作用機制。方法 小鼠分為假手術組、藥物對照組、缺血組、藥物保護組;采用激光共聚焦顯微鏡方法觀察腦缺血后膠質增生及IL��1β表達情況;采用Western印跡方法檢測腦缺血后核因子(NF)�拨蔅 p50及 p65蛋白的表達。結果 缺血組與假手術組比較GFAP�睮L��1β共表達陽性細胞(黃色)數量明顯增加(P<0.01);藥物保護組與缺血組比較GFAP�睮L��1β共表達細胞(黃色)數量明顯減少(P<0.01)。缺血組與假手術組比較NF�拨蔅 p50蛋白表達量增加(P<0.05);藥物保護組與缺血組比較NF�拨蔅 p50蛋白表達量減少(P<0.05)。缺血組與假手術組比較NF�拨蔅 p65蛋白表達量增加(P<0.05);藥物保護組與缺血組比較NF�拨蔅 p65蛋白表達量減少(P<0.05)。結論 喹硫平能夠減輕小鼠腦缺血后膠質增生及IL��1β表達，其機制可能和調節NF�拨蔅的活性有關。

【關鍵詞】  喹硫平;核因子�拨蔅;IL��1β

　 腦缺血的臨床表現不僅包括運動、感覺、視覺功能障礙，也包括遺忘、忽略等，而且常伴有情緒紊亂、抑郁焦慮及精神癥狀，這些均抑制腦缺血后生理和認知功能的恢復〔1,2〕。近幾年，很多證據表明一些非典型抗精神失常藥具有神經保護作用。本研究以小鼠腦缺血為模型研究非典型抗精神病藥喹硫平是否對腦缺血具有保護作用，探討喹硫平對腦缺血后膠質細胞增生及白細胞介素��1β(IL��1β)表達的影響及其機制。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗動物 雄性ICR小鼠48只，重量18～20 g，正常飲食和光照時間，室溫下飼養。

　　1.2 動物模型制備 用氯胺酮(110 mg/kg)和甲苯噻嗪(15 mg/kg)麻醉，麻醉后沿腹正中線切口，分離雙側頸總動脈并用棉線阻斷雙側頸總動脈血流60 min，之后撤掉棉線觀察血液復流，然后縫合腹正中線切口。假手術組執行相同程序，但不閉塞雙側的頸總動脈。手術后用熱毯維持小鼠在正常體溫。

　　1.3 給藥方法 喹硫平溶于無菌生理鹽水中，參照實驗方法〔3,4〕，采用喹硫平10 mg/kg，缺血手術后給予小鼠喹硫平10 mg/kg或生理鹽水腹腔注射，1次/d，共4 w。

　　1.4 分組 實驗動物分為4組：腦缺血組閉塞雙側的頸總動脈然后給予生理鹽水腹腔注射;假手術組執行假手術然后給予生理鹽水腹腔注射;藥物對照組執行假手術然后給予喹硫平10 mg/kg腹腔注射;藥物保護組閉塞雙側的頸總動脈然后給予喹硫平10 mg/kg腹腔注射，每組小鼠12只。

　　1.5 方法學術論文發表

　　1.5.1 激光共聚焦顯微鏡檢測神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)�睮L��1β共表達 將組織切片在二甲苯中浸3次，正常山羊血清封閉，分別滴加50 μl的1∶1混合的兔抗大鼠GFAP(1∶100)和小鼠抗大鼠IL��1β(1∶200)，設空白對照〔無一抗，加磷酸鹽緩沖液(PBS)〕和抗體特異性對照(加一抗不加二抗，加二抗不加一抗)，所有切片同時染色。切片一抗及二抗加入后，置于濕盒內，4℃過夜。激光共聚焦顯微鏡觀察。

　　1.5.2 蛋白質印跡(Western印跡)檢測各組核轉錄因子�拨蔅(NF�拨蔅)p50和p65蛋白表達 取海馬組織勻漿，然后用凝膠加樣緩沖液重懸，沸水浴中加熱10 min。蛋白定量后，用同一蛋白含量上樣跑十二烷基硫酸鈉�簿郾�烯酰胺凝膠電泳(SDS�睵AGE)，然后轉移到尼龍膜上，封閉液封閉，加入含有一抗(兔抗NF�拨蔅 p50和p65特異性抗體)的3 ml反應液，4℃溫育2 h,然后加入含有二抗(羊抗兔IgG)的3 ml反應液，顯色拍照。

　　1.6 統計學分析 采用SPSS13.0軟件，計量資料以x±s表示，采用兩因素方差分析比較各組間的差異，然后進行t檢驗。

　　2 結 果中國論文發表

　　圖1 缺血再灌注后4 w GFAP�睮L��1β海馬齒狀

　　回區激光共聚焦顯微鏡觀察(×400) 缺血組與假手術組比較，GFAP�睮L��1β共表達陽性細胞(黃色)數量明顯增加(P<0.01);藥物保護組與缺血組比較GFAP�睮L��1β共表達陽性細胞(黃色)數量明顯減少(P<0.01)。見圖1。缺血組與假手術組比較p65蛋白表達量增加(P<0.05);藥物保護組與缺血組比較p65蛋白表達量減少(P<0.05)。見圖2。缺血組與假手術組比較p50蛋白表達量增加(P<0.05);藥物保護組與缺血組比較p50蛋白表達量減少(P<0.05)。見圖3。

3 討 論

　　非典型抗精神失常藥物具有神經保護作用，其中非典型抗精神失常藥喹硫平可有效緩解N�布谆���4苯基吡啶(MPP+)、H2O2及β淀粉樣肽等由于氧化應激所誘導的嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞死亡〔5,6〕。這些神經保護作用的機制包括影響Bax/Bcl�瞲l的轉位和表達或超氧化物歧化酶(SOD)��1的上調〔5，7〕。動物實驗表明喹硫平能有效緩解慢性應激導致的海馬腦源性神經營養因子(BDNF)和細胞增生的縮減〔8〕，而且能有效緩解安非他明誘導的行為學改變和對多巴胺神經末梢的毒性作用〔4〕。

　　星形膠質細胞在維持神經元正常活性方面發揮重要作用，包括谷氨酸的攝取、釋放，鉀離子及氫離子的平衡緩沖以及水的轉運。腦缺血后反應性的星形膠質細胞增生，但過度增生活化的膠質細胞可以釋放有害因子如腫瘤壞死因子(TNF)、IL��1β、干擾素(IFN)等導致遲發性神經元死亡(DND)。IL��1β可以通過刺激內皮細胞表達白細胞黏附分子，使白細胞聚集在缺血腦組織，引發炎癥反應加重腦組織損害〔9〕。過度增殖的膠質細胞尤其是膠質疤痕的形成不僅可影響到神經元軸突的生長、突觸的重建及阻斷腦組織微循環〔10〕，而且還是腦血管病后癲癇發病的根源，因此膠質細胞對神經元的作用具有利弊雙重性。抑制腦缺血后過度的膠質細胞增生及炎癥反應成為腦缺血后神經功能重建目標的重要途徑之一。喹硫平在改善腦缺血后精神癥狀同時也能夠減輕腦缺血后認知功能的損傷〔11〕。職稱論文發表費用

　　頸總動脈閉塞(CCAO)能阻斷85%的腦血流并足以誘導小鼠神經元損傷而且死亡率僅有5%，經過30、60、90 min模型發現，60 min CCAO在小鼠模型中產生明顯的急性神經變性和記憶損傷〔12，13〕。海馬是應激激素產生的器官，同時也是對缺血很敏感的區域。本文采用激光共聚焦顯微鏡觀察方法評價腦缺血后的膠質細胞增生和炎癥反應及喹硫平對腦缺血后炎癥反應的作用。GFAP表達量的增加通常被作為星形膠質細胞在中樞神經系統(CNS)損傷后活化和增殖的標志。本研究發現喹硫平減少腦缺血后IL��1β�睪FAP的共表達，減輕腦缺血后的膠質增生及IL��1β的表達。

　　NF�拨蔅是一種在機體受到應激性刺激后活化并參與調控一系列基因轉錄的關鍵性核轉錄因子，作為一種在轉錄水平調控基因表達的因子，是各種信號轉導途徑的樞紐環節。NF�拨蔅在腦缺血損傷中促進炎癥的發生發展、誘導細胞凋亡、介導自由基損傷〔14〕。腦缺血損傷發生后，NF�拨蔅上調細胞因子IL��1β的表達，IL��1β反過來又可以激活NF�拨蔅，從而使NF�拨蔅活化在組織間不斷擴散，加重了炎癥反應〔15〕。伴隨反應性膠質增生，GFAP膠質纖維酸性蛋白表達量增加，NF�拨蔅的活性可影響GFAP的表達水平，NF�拨蔅在GFAP的基因表達中可能扮演重要的角色。有一個NF�拨蔅的結合位點存在于鼠和人的GFAP基因啟動子上〔16〕。

　　本研究結果顯示，腦缺血再灌注后NF�拨蔅 p50和 p65表達量增加，喹硫平能夠減少腦缺血再灌注后NF�拨蔅 p50和 p65的表達。因此，喹硫平可以減輕星型膠質細胞激活反應，同時減輕腦缺血再灌注后IL��1β的表達，其機制可能和調節NF�拨蔅蛋白的表達水平有關。

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