大鼠頸動脈球囊損傷后平滑肌細胞mTOR�睵70S6K表達

【摘要】  目的 探討姜黃素對雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核糖體蛋白質S6激酶(P70S6K)在血管平滑肌細胞增殖中的作用。方法 54只雄性SD大鼠隨機分為對照組、損傷組和藥物干預組。頸動脈HE染色和組織病理圖像分析;免疫組織化學觀察PCNA與P70S6K組織表達中的病理變化;實時定量PCR檢測mTOR�睵70S6K及PCNA的mRNA表達;ELISA測定血清白介素��18(IL��18)水平變化。結果 實驗術中死亡大鼠1只，取材過程中發現動脈閉塞5只(分別為3 d藥物干預組和7 d損傷組各1只，14和28 d藥物干預組各2只)。 HE染色顯示14 d藥物干預組與損傷組相比內膜與中膜增殖厚度明顯減低，組織圖像分析三組之間內膜厚度差異無統計學意義，而中膜厚度差異具有統計學差異(P=0.000);免疫組化結果示對照組與損傷組及藥物干預組存在差異(P=0.045);實時熒光定量PCR mTOR�睵70S6K及PCNA的mRNA損傷組與對照組相比具有統計學意義(P<0.05);ELISA示與對照組相比姜黃素能抑制第3、7、14天藥物干預組血清IL��18濃度，具有統計學意義(P均<0.05)。結論 姜黃素能夠抑制IL��18、mTOR�睵70S6k及PCNA在損傷血管平滑肌細胞中的表達，并能抑制平滑肌細胞增殖，可能成為預防再狹窄的新藥物。

【關鍵詞】  姜黃素;血管平滑肌細胞;白介素��18;雷帕霉素靶蛋白;核糖體蛋白質S6激酶

　 近年來，心血管病特別是冠心病的高發病率、高致殘率和高死亡率給社會及居民造成沉重負擔。經皮冠脈介入(PCI)已成為治療冠心病的最有效手段之一，但是其長期獲益受到了血管再狹窄的限制，Odell和Garg等〔1，2〕研究表明，支架植入術后9個月再狹窄率為5%～8%以上。藥物涂層支架使再狹窄率明顯下降，但晚期支架內血栓引起了人們的關注〔3〕。盡管臨床上給予PCI術后雙聯甚至三聯抗血小板藥物，但再狹窄仍是支架置入術后預防的重點和難點。球囊機械損傷，冠脈再狹窄的主要原因是由于血管平滑肌細胞(VSCM)的異常增殖、遷移和纖維化。姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種主要成分，其通過下調P13K/Akt通路抑制VSMC增殖與遷移。姜黃素已用于生物可吸收支架，對PCI術后再狹窄及支架內血栓起到抗增殖及預防作用〔4〕。目前國內對雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖體蛋白質S6激酶(P70S6K)與白介素��18(IL��18)和再狹窄關系研究未見相關文獻報道。本實驗在于討論姜黃素是否能夠通過降低mTOR�睵70S6K及IL��18的表達，從而降低PCI術后再狹窄的發生。

　　1 材料與方法

　　1.1 主要藥物及試劑 98%高效液相色譜姜黃素購于陜西森弗生物技術公司;IL��18 ELISA試劑盒及RNA純化試劑Trizol分別購于美國ADL公司與Invitrogen公司;RT�睵CR反轉錄試劑盒和PCR試劑盒購于日本Toyobo公司;PCNA和P70S6K抗體購于美國BioworlD公司，免疫組化二抗試劑盒購于中國武漢博士德公司。

　　1.2 實驗方法園藝論文發表

　　1.2.1 動物分組及模型 54只(7～8周齡)無特殊病原體(SPF)級雄性SD大鼠由甘肅中醫學院動物實驗中心提供，體重(300±50)g。動物批號：scxk(甘) 2004��0006。隨機分為對照組(假手術組)6只，損傷組與藥物干預組(損傷加藥物)各24只，又分別分為3、7、14及28 d組。戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉后，尾靜脈給予肝素100 U/kg。頸前正中切開皮膚及皮下組織，動脈夾分別夾住頸總動脈和頸內動脈，在頸外動脈剪一楔形切口，插入2 F(2×20 mm)球囊(Medtronic，美國)，注入生理鹽水0.2 ml使其膨脹，緩慢回拉球囊至平切口處，抽出球囊內液體，重復上述過程三次，退出球囊，結扎頸外動脈，恢復血流。慶大霉素40萬U沖洗切口后縫合皮下組織及皮膚。青霉素40萬U/d肌肉注射，連續3 d。普通飼料喂養，自由飲水。對照組僅切開皮膚分離皮下組織，不插入球囊，藥物干預組給予姜黃素100 mg·kg-1·d-1灌胃。取材：所有動物分別在第3，7，14和28天麻醉后取全血及左側頸總動脈后脫臼處死。全血4 000 r/min離心 20 min取上清-20℃冰箱保存;頸總動脈經肝素生理鹽水沖洗后分兩等份，40 g/L甲醛固定和液氮保存。

　　1.2.2 IL��18檢測 ELISA按試劑盒操作說明進行操作。

　　1.2.3 組織病理(HE)及圖像分析及免疫組織化學 將病理標本在40 g/L中性甲醛液中固定24 h后，逐級乙醇脫水，石蠟包埋，間斷均勻切片(片厚5 μm)。對病理切片行免疫組化染色，觀察受損血管組織形態學改變、同時采用計算機全自動圖像分析系統測定受損血管內膜與中膜厚度。

　　1.2.4 實時定量PCR醫學核心期刊論文發表

　　1.2.4.1 引物設計與合成 根據Genbank提供的基因序列及引物設計原則應用Primer Premier 5和Oligo 6引物設計軟件，自行設計引物，由北京三博遠志公司合成。mTOR正鏈5′�睪AATCAGACAGGCACGAAGG��3′，反鏈 5′�睺CTTCTTCCAGCAAGTTCAGC��3′;P70S6K正鏈5′�睞AAGAAGAGGAAGCTGT��3′，反鏈5′�睠TTTAAGTGTCCCATGTCAG��3′;PCNA正鏈5′�睞AAGAAGAGGAAGCTGT��3′，反鏈 5′�睠TTTAAGTGTCCCATGTCAG��3′;β�瞐ctin正鏈5′�睺TGCTGATCCACATCTGCTG��3′，反鏈5′�睪ACAGGATGCAGAAGGAGAT��3′。

　　1.2.4.2 Trizol法抽提總RNA與cDNA合成 將100 mg血管研成勻漿，加入Trizol 1.0 ml，室溫靜置5 min;加入氯仿1/5體積，4℃ 12 000 g離心15 min，抽取上清約500～600 μl，加入異丙醇500 μl混勻，-20℃過夜;過夜后4℃ 7 500 r/min離心10 min，棄上清，無水乙醇1 ml洗滌2次，4 ℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清，室溫放置25 min，加DEPC水30 μl，立即逆轉錄(根據試劑盒說明書進行)或保存液氮中。

1.2.4.3 PCR反應步驟 PCR反應體系為25 μl，包括蒸餾水5.5 μl;SYBR GreenⅠ12.5 μl;Plus solution 2.5 μl;上下游引物各1 μl;cDNA 2.5 μl。變性95 ℃ 15 s，退火57 ℃ 15 s，延伸72℃ 45 s，共40循環。

　　1.3 統計方法處理 所有資料以x±s表示，組間數據比較采用方差分析;秩和檢驗分析等級資料，應用SPSS11.0軟件包進行統計學分析。

　　2 結 果

　　2.1 各組血清IL��18結果 見表1。第3、7天損傷組及藥物干預組IL��18水平較對照組明顯增高(P<0.05)，第14天損傷組高于對照組(P<0.05)。第3、7、14天藥物干預組較損傷組

　　低(P<0.05)。環保論文發表

　　2.2 HE及免疫組織化學 對照組光鏡下內皮細胞和內彈力膜完整，中層VSMC呈梭形，胞核小而扁。損傷組損傷后7 d光鏡下管腔面有較完整的扁平內皮，增生的內膜呈均勻性或非均勻性增厚，有遷移的VSMC和少許纖維組織形成;損傷后14、