炎癥因子在尿毒癥大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用

【摘要】  目的 觀察尿毒癥大鼠腦缺血再灌注(I/R)后炎癥因子的動態變化。方法 清潔級健康雄性Wistar大鼠30只，隨機分為單純尿毒癥組(CRF組)6只、尿毒癥合并腦I/R組(CRF+I/R組)24只，制備尿毒癥模型，成模后，再取同樣大鼠30只，隨機分為正常對照組6只、單純腦I/R組24只。將I/R組和CRF+I/R組大鼠再制作大腦中動脈栓塞模型，腦缺血2 h后再灌注，按再灌注后不同時間點(0、2、12、24 h)I/R組、CRF+I/R組又分為4個亞組，每個亞組6只。I/R組和CRF+I/R組按再灌注后的時間點取材，正常對照組在飼養3～7 d后取材，CRF組在成模后0～3 d取材，RT�睵CR法檢測腦組織中TNF�拨痢�IL��1β、IL��6 mRNA表達情況。結果 TNF�拨� mRNA：正常對照組與CRF組大鼠腦組織TNF�拨� mRNA的表達差異不顯著(P>0.05)，CRF組大鼠TNF�拨� mRNA的表達較I/R組各時間點均降低(P<0.05);腦I/R兩組大鼠TNF�拨� mRNA在2 h時間點表達最強，此后逐漸下降;CRF+I/R組大鼠各時間點TNF�拨� mRNA的表達均較CRF組、I/R組升高(P<0.05)。IL��1β mRNA、IL��6 mRNA：CRF組大鼠IL��1β mRNA、IL��6 mRNA的表達均較正常對照組升高，但差異不顯著(P>0.05);與I/R組各時間點相比，CRF組大鼠IL��1β mRNA、IL��6 mRNA的表達均明顯偏低(P<0.05);腦I/R兩組大鼠腦組織中IL��1β、IL��6 mRNA表達隨再灌注時間延長逐漸升高，至24 h達高峰;與I/R組和CRF組相比，CRF+I/R組各時間點IL��1β mRNA和IL��6 mRNA表達均顯著升高(P<0.05)。結論 炎癥因子參與了尿毒癥大鼠的腦I/R損傷，提示尿毒癥的微炎癥狀態對神經系統具有一定的影響。

【關鍵詞】  尿毒癥;腦缺血再灌注;炎癥因子

　　 近年來，隨著肥胖、高血壓、糖尿病及高齡人群的不斷增多，慢性腎臟病(CKD)和腦血管病的發病率呈逐年增高趨勢，已成為人類面臨的嚴重公共衛生問題〔1〕。尿毒癥是各種原發或繼發的慢性腎臟疾病不斷惡化、進展的最終階段，此時腎臟功能嚴重受損，大量代謝產物在體內蓄積，加之鈉水潴留，造成病人體內酸堿平衡紊亂及全身各系統功能失調，其中心腦血管系統受累最重，是影響尿毒癥患者預后的主要因素;在中樞神經系統，尿毒癥病人腦血管病的發病率較高，其死亡率即使在透析病人中也占很大比率。然而，有關尿毒癥病人發生腦缺血再灌注(I/R)損傷后的病理生理變化及其機制尚未見報道。本文以尿毒癥大鼠為研究對象，動態觀察其發生腦I/R后腦組織中炎癥因子的變化，從而明確尿毒癥體內長期存在的微炎癥狀態對中樞神經系統的影響，為臨床治療尿毒癥合并缺血性腦血管病提供新的理論依據。

　　1 材料與方法英文論文發表

　　1.1 實驗動物 清潔級健康雄性Wistar大鼠30只，體重250～280 g，實驗室條件適應性喂養1 w，術前自由進食飲水，隨機分為單純尿毒癥組(CRF組)6只、尿毒癥合并腦I/R組(CRF+I/R組)24只，制備尿毒癥模型，成模后，再取同樣大鼠30只，隨機分為正常對照組6只、單純腦I/R組48只。所有4組大鼠中，除正常對照組和CRF組外，其余兩組大鼠再制作大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。腦缺血2 h后再灌注，按再灌注后不同時間點(0、2、12、24 h)I/R組、CRF+I/R組又分為4個亞組，每個亞組6只。首先參照文獻方法〔2〕，制備5/6腎切除尿毒癥大鼠模型：10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)大鼠腹腔注射，麻醉后俯臥位固定鼠臺上，于脊柱兩側腎臟部位剪毛，碘伏常規消毒皮膚，戴無菌手套，鋪無菌洞巾。行左背部斜切口，剪開皮膚及肌肉，暴露左側腎臟，剝離腎包膜，結扎(7號線)左腎上、下極，盡量結扎皮質約2/3的腎組織，切除結扎部分，立即以吸收性明膠海綿壓迫止血，無明顯出血后復位腎臟，縫合各層組織，術后切口碘伏消毒。術后腹腔注射青霉素7.2萬U/100 g，連用3 d。1 w后進行第2次手術，在脊柱右側斜切口，剝離肌層，結扎腎門部位，切除右側腎臟。縫合各層組織，術后切口碘伏消毒。腹腔注射青霉素3 d(劑量同前)。此模型制備成功后，再參照文獻〔3〕，制備大鼠大腦MCAO模型：用10%水合氯醛將大鼠腹腔注射麻醉后，仰臥位固定在實驗臺上，沿頸部中線切開皮膚，鈍性分離皮下組織。解剖顯微鏡下分離左側頸總動脈(CCA)，置線備用。向上分離左頸外動脈(ECA)及頸內動脈(ICA)，電凝ECA兩分支甲狀腺上動脈及枕動脈，在距CCA分叉處約5～8 mm處結扎ECA，于ICA及CCA近心端分別夾一微動脈夾，在ECA近分叉處留置一打好單節的絲線，勿收緊線結，在ECA結扎處與留置的絲線之間做一直徑約0.2 mm的“V”型微切口，將尼龍線頭自切口處輕輕插入，輕輕收緊線結，將ECA于結扎線近心端剪斷，使之與頸內動脈方向一致。松開動脈夾，將尼龍線順ECA插入到ICA顱內段。此時注意ICA在顱外有一較大的分支翼突顎動脈，避免將線插入此分支。插入深度約20 mm微遇阻力時停止，使尼龍線頭端位于MCA起始處，阻斷MCA的血流。收緊絲線，插線的末端固定于ECA殘端外。缺血2 h后，輕輕外抽尼龍線使之頭端回到ECA結扎處，即可使大腦中動脈恢復血供，實現再灌注，剪斷插線皮外段，縫合頸部切口。模型判定：CRF大鼠于術后12 w麻醉后尾靜脈取血，檢測腎功能、血常規指標，將血清肌酐達到120 μmol/L作為CRF的指標。MCAO模型按Zea�睱onga 5分制標準評分：0分，無神經缺損癥狀;1分，不能伸展對側前爪;2分，行走時向偏癱側轉圈;3分，向偏癱側傾倒;4分，不能自發行走，意識喪失。其中0分和4分者被剔除。實驗過程中，手術不成功、造模失敗及24 h內死亡的大鼠均棄之不用。用同一批次的大鼠制成合格模型后補足數目。
　1.2 取材 每個亞組及正常對照組、CRF組各取6只大鼠，正常對照組在飼養3～7 d后取材，CRF組在成模后0～3 d取材。待所有模型制備成功后，每個亞組分別于再灌注后0、2、6、24 h取材。以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，快速剪開腹腔和胸腔前壁，清晰暴露出心臟和升主動脈，用連有輸液管的預處理為鈍圓的針頭由心尖處插入左心室，并通過心腔插入升主動脈，向內快速輸入預冷為4℃的生理鹽水，同時用眼科剪剪破右心耳，使血液從右心耳流出，待流出液變清后，換上4℃的pH7.4的磷酸緩沖液配成的含4%多聚甲醛的固定液進行快速全身灌流固定，直到動物全身呈僵直狀態。灌流結束后斷頭取出完整大腦，自視交叉前后冠狀位取4 mm厚的腦組織放入凍存管，立即置于液氮中保存。

　　1.3 采用RT�睵CR法檢測各組大鼠腦組織中TNF�拨痢�IL��1β、IL��6 mRNA表達 TNF�拨恋纳嫌我�物：5′CGAGTGACAAGCCCGTAGCC��3′，下游引物：5′GGATGAACA CGCCAGTCGCC��3′，擴增片段753 bp。IL��1β上游引物：5′TCCCATTAGACAGCTGCA CTG��3′，下游引物：5′GCTCTGCTTGAGAGGTGCTGA��3′，擴增片段383 bp。IL