大鼠完全性脊髓橫斷及坐骨神經損傷后運動終板變化

【摘要】  目的 研究完全性脊髓橫斷及坐骨神經損傷后損傷平面以下乙酰膽堿酯酶(AChE)、降鈣素基因相關肽(calcitonin gene�瞨elated peptide ，CGRP)在骨骼肌運動終板中的變化。方法 選取57只雌性大鼠，30只制作成完全性脊髓損傷及修復模型，24只制作成坐骨神經損傷模型，通過AchE組化染色、鍍銀染色和CGRP免疫組織化學法觀察脊髓損傷和坐骨神經損傷后AChE、CGRP在運動終板分別1 w、1、3、6、12個月的改變。結果 脊髓損傷后1 w、1個月AChE組織化學顯示與正常運動終板相比無明顯變化(P>0.05)。至3、6、12個月與正常相比有統計學差異(P<0.05);但12個月與6個月相比無統計學差異。脊髓損傷后3個月時，CGRP免疫染色陽性部分與正常組相比有明顯統計學差異(P<0.01)。至6、12個月CGRP免疫陽性染色部位與正常相比有統計學意義(P<0.05)。而坐骨神經損傷后AChE含量下降，終板退變，CGRP含量明顯降低甚至消失，鍍銀染色未發現改變。結論 脊髓損傷后功能相關蛋白含量下降，終板發生退變，退變程度明顯較周圍神經損傷后輕，這對于改善損傷脊髓功能后恢復運動功能提供了可能。

【關鍵詞】  運動終板;乙酰膽堿酯酶;降鈣素基因相關肽;脊髓損傷;坐骨神經

 運動終板是運動神經元末梢與肌纖維連接的特化結構，損傷后其運動功能的恢復要依賴于運動終板結構的保存、再生、重建及其正常生理功能的恢復。運動終板的病理變化和功能與選擇的治療方法、治療效果的評價存在著密切的關系。目前對于神經系統損傷后尤其是脊髓損傷后損傷平面以下聯系效應器(骨骼肌)的神經乃至運動終板發生怎樣的變化及變化程度文獻報道亦有差異〔1，2〕，本研究采用組織化學、免疫組化等方法研究脊髓及坐骨神經損傷后乙酰膽堿酯酶(AChE)、降鈣素基因相關肽(CGRP)在骨骼肌運動終板中的變化，探討脊髓損傷后損傷平面以下骨骼肌的功能情況，為改善損傷后脊髓功能的研究奠定基礎。

　　1 材料與方法

　　1.1 動物模型制作 選取成年雌性Wistar大鼠57只，體重(230±20)g。隨機選取30只大鼠制作完全性脊髓損傷及修復模型，另取3只作為正常對照。6%水合氯醛6 ml/kg腹腔麻醉，顯微鏡下打開T7～T8胸椎，暴露T9～T10脊髓，在T10脊髓節段切除一段長3 mm左右的脊髓，縫合硬脊膜、背部肌肉和皮膚，制成脊髓損傷組模型。將其余24只大鼠制作坐骨神經損傷模型，6%水合氯醛6 ml/kg腹腔麻醉大鼠，切開大鼠左側后肢皮膚和肌肉，暴露坐骨神經;將大鼠左側坐骨神經于梨狀肌大孔下1 cm處切斷，并將中樞斷端旋轉180°后反折，用8/0線固定于梨狀肌下，防止自發性再生對實驗的影響，縫合肌肉和皮膚，制成坐骨神經損傷模型。

　　1.2 取材和切片 脊髓損傷組大鼠于術后1 w、1、3、6和12個月，坐骨神經損傷組大鼠于術后1 w、1、2和4個月以4%多聚甲醛心臟灌流固定，取大鼠腓腸肌標本，將標本用4%多聚甲醛固定12 h后，放入30%蔗糖磷酸緩沖液1～2 d后行連續冰凍橫行和縱形切片。切片厚度為35 μm，將縱切片分為兩組，一組進行AChE組化染色，一組進行鍍銀染色;橫切片行CGRP免疫組化染色。高級會計師論文發表

　　1.3 運動終板及周圍神經纖維染色 一組切片采用改良Koelle AchE染色法，顯示終板AChE;一組切片用Gros�睟ielshowsky法顯示神經末梢;另一組切片行CGRP免疫組化染色：切片0.1 mol/L PBST液中浸泡5 min，1N鹽酸修復抗原，3% H2O2 10 min后血清封閉，直接加入兔來源的CGRP多克隆抗體(1∶2 000，Sigma公司)，4℃過夜。二抗生物素化的山羊抗兔IgG(1∶300，北京中山試劑公司)室溫3 h，三抗(1∶300，北京中山試劑公司)，室溫孵育3 h，DAB顯色并于普通光學顯微鏡下觀察。

　　1.4 運動終板及周圍神經纖維的形態組織學觀察和形態定量分析 應用Leica Qin圖像分析系統測量AChE、CGRP陽性部位的透光度值及其面積。

　　1.5 統計學分析 用SPSS11.5 統計軟件對數據進行統計分析，數值以x±s表示，采用單因素方差分析進行統計學檢驗。
2 結 果

　　2.1 AChE染色結果 正常大鼠腓腸肌運動終板為棕黑色、細顆粒狀亞鐵氰化銅沉淀，在縱切面上其形狀為橢圓形或卵圓形，大小為20～40 μm，邊緣清晰銳利，著色均勻，一根肌纖維上只能見到一個運動終板。脊髓損傷后1 w AChE組織化學顯示運動終板染色均勻且色深，與正常運動終板相比無明顯變化(P>0.05)。1個月時運動終板著色稍有變淺，至3月時，運動終板染色變淺，中央部分陽性著色變淺更加明顯，與正常相比有統計學差異(P<0.05);6個月時著色明顯變淺，在著色中央的周圍尤其明顯，AChE著色彌散，部分運動終板呈中央著色較深、周圍著色淺、邊緣銳利的空泡樣改變;12個月時以終板中央變淺明顯，但與6個月相比無統計學差異，終板呈均勻淺染的空泡樣結構。在坐骨神經損傷的實驗中，1 w時運動終板在著色、數量上與正常組無明顯差別，肌纖維雖已有一定程度萎縮，但終板區AChE含量無明顯改變，由于肌肉萎縮，AChE更加集中，有些部位著色比正常略深。損傷后1個月，著色開始變淺，形態也比正常稍小。損傷后4個月，腓腸肌變化更加顯著，著色更淺，且不易辨認，染色更加不均勻，且由于肌纖維嚴重萎縮而顯得大多數MEP幾乎占據整個肌纖維的橫徑(圖1)。

　　2.2 鍍銀染色結果 正常大鼠腓腸肌切片鍍銀染色可見神經及其分支。在脊髓損傷組各個時間點大鼠腓腸肌切片鍍銀染色均可清晰地看到神經及其分支，各組和各時間點之間未發現明顯差別。坐骨神經損傷組動物在術后1 w(圖2)至術后4個月，神經退變嚴重以致只能看到有部分終板銀染而無神經及其分支。

　　2.3 CGRP免疫組化染色結果 正常組大鼠腓腸肌中可見運動終板被CGRP抗體清晰標記，顯示CGRP免疫陽性標記與AChE組織化學顯示的運動終板分布一致。CGRP免疫組化染色陽性部分(運動終板區域)分布較均勻，著色清晰，顏色相對較深，結構界限較清晰。脊髓損傷后1 w CGRP免疫陽性染色部分結構較清晰，但著色明顯變淺;4 w時CGRP免疫陽性染色部位著色繼續變淺;至3個月時，CGRP免疫染色陽性部分較之前更淺，與正常組相比有明顯統計學差異(P<0.01),并且部分運動終板出現染色變模糊;至6個月時CGRP免疫陽性染色部位較前明顯加深，12個月時CGRP免疫陽性染色部分著色較正常組更深，與正常相比差異顯著(P<0.05)。大鼠坐骨神經損傷后1 w直到術后4個月，大鼠腓腸肌CGRP染色后均未觀察到CGRP陽性標記物(圖3)。

　　3 討 論心理學論文發表

　　運動終板是連接神經和效應器(肌肉)的關鍵部位，正常生理情況下，運動神經元通過終板與骨骼肌相聯系，支配骨骼肌完成各種生理功能。AChE主要來源于運動神經元的胞體，通過軸漿運輸運送到神經終末，并釋放到突觸間隙，水解乙酰膽堿。研究認為周圍神經離斷后遠端及去神經支配骨骼肌的AchE活性明顯減低，之后AchE陽性反應的出現可認為是神經纖維再生標志之一。AChE活性的強弱反映運動神經元的功能狀態，終板區AChE