生姜透皮貼對運動病大鼠腦組織中三種酶活性的影響

【摘要】  目的 通過建立運動病模型，檢測生姜透皮貼對運動病大鼠腦組織中堿性磷酸酶(AOP)、Na+�睰+�睞TP酶和細胞色素氧化酶(CCO)活性的變化，并探討其治療運動病的機制。方法 雄性SD大鼠40只，隨機分5組，每組8只，每天按實驗方法刺激，同時實驗組給予生姜透皮貼治療。實驗第3天刺激結束后迅速斷頭處死，冰上迅速分離腦組織，取大腦皮質和小腦皮質、腦干前庭區。采用組織化學定位方法和圖像定量分析方法，檢測各組大鼠上述三部位腦組織中ALP、Na+�睰+�睞TP酶及CCO活性。結果 運動病大鼠三部位腦組織中ALP活性顯著升高、Na+�睰+�睞TP酶及CCO活性明顯降低。與模型組相比，使用生姜透皮貼后運動病大鼠三部位腦組織中ALP活性顯著減低、Na+�� K+�睞TP酶及CCO活性明顯升高。結論 生姜透皮貼可能通過降低腦血管緊張度，改善腦血流的分布，增加腦血流量，調整腦細胞內CCO、ALP、Na+�睰+�睞TP酶等酶的活性，增強腦細胞的興奮性，從而保持中樞神經系統的興奮性，起到抗運動病的作用。

【關鍵詞】  生姜透皮貼;運動病;堿性磷酸酶;Na+�睰+�睞TP酶;細胞色素氧化酶

　 隨著現代航天航海事業的發展，世界各國都在開展運動病的研究工作，對防治運動病的研究已經取得了一定的成果，但尚無公認的療效確切、副作用少的治療措施。尋找更為有效、更安全的抗運動病方法日益引起國內外重視。目前的抗運動病藥物主要包括抗膽堿、抗組胺類及擬交感胺類等，雖有一定的抗運動病作用，但多有中樞抑制作用，限制了其臨床使用。而我國自古就應用中草藥生姜抗眩暈病，生姜有確切的抗運動病防止暈車、暈船的作用〔1〕。美國科學家也證明生姜確有防暈船等效果〔2〕，且相對其他防暈船藥物相比，無口干，昏睡，血壓降低等副作用。近年來，國內學者進行的動物實驗證實，生姜的有效成分有明顯的止吐抗運動病的作用〔3〕，且無明顯副作用。南通醫學院航海醫學研究所與南通市中醫院聯合研究的生姜合劑由生姜、半夏等6味中藥組成〔4〕，及單獨的生姜粉等用于防治運動病，效果較暈海寧強，副作用不明顯，因而生姜成為各國學者普遍看好的新的抗運動病藥物。本實驗運用乙醇法提取生姜有效成分，將其與透皮劑氮酮混合制成帖劑貼在運動病大鼠的臍部〔5〕，測定大鼠大腦皮質、小腦皮質、腦干前庭區腦細胞中Na+�睰+�睞TP酶、堿性磷酸酶(ALP)、細胞色素氧化酶(CCO)活性變化〔6〕，透皮療法使藥效發揮更加持久，而且方法簡便，作用迅速〔7〕，為抗運動病新型藥物的研究提供新的思路。

　　1 材料與方法

　　1.1 動物及分組 雄性SD大鼠40只、體重(200±10) g，購自湖北省實驗動物中心，動物合格證號：SYXK(鄂)2003��0007，檢疫后備用。單籠飼養，自由攝食水，飼養1 w后開始實驗。隨機分5組，分別是正常組、模型組和生姜高、中、低劑量組，每組8只。模型組和生姜組大鼠臍部脫毛，每天將透皮貼貼在臍部，給藥30 min。隨后給予2 h的運動病刺激：將大鼠無束縛地放入旋轉裝置中的有機玻璃籠內，先順時針方向加速度從16°/S2加速至120°/S2，然后立即以45°/S2減速至0，馬上逆時針再以16°/S2加速至120°/S2，然后以45°/S2減速至0，如此反復。旋轉時間為2 h〔8〕，除正常組不接受旋轉刺激外，其他各組處理相同，旋轉刺激完成后動物放回飼養籠中。連續刺激3 d，1次/d。每天觀察動物接受刺激后的反應情況，第3天刺激結束后取動物迅速斷頭處死，冰上迅速分離腦組織，取出大鼠三部位腦組織，放入液氮，轉入-80℃冰箱備用。中國論文發表

　　1.2 藥品與材料 生姜透皮貼：生姜(華中科技大學鑒定)清洗去雜切碎，雙蒸水浸泡，閃式提取器提取，過濾，濾液減壓濃縮至浸膏狀，按50、100和200 mg/kg將生姜浸膏與氮酮混勻，制成3 cm×4 cm生姜透皮貼，另用氮酮制作空白貼劑供模型組使用。ALP試劑盒(批號：060101)、Na+�睰+�睞TP酶試劑盒(批號：060101)、CCO試劑盒(批號：060101)均購自南京建成生物工程研究所。

　　1.3 實驗儀器 低溫高速離心機(Backman)、電熱恒溫水溫箱 (上海醫療器械七廠)、721分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

　　1.4 酶細胞化學反應 將組織用含2%多聚甲醛、0.5%戊二醛的二甲砷酸鈉緩沖液固定液(pH1.4　0.1 mol/L) 4℃固定1 h。二甲砷酸鈉緩沖液漂洗后，與液氮冷凍后兩組樣品并列放在一起,恒冷箱冷凍切片為10 μm，分別測定進行Na+�睰+�睞TP酶、ALP和CCO〔9〕。用1%鋨酸固定1 h，EPON812包埋，LKB超薄片機切片，不進行電子染色，直接在HITACHI�睭300型電鏡下觀察。學術論文發表

　　1.5 酶活性定量分析 采用XY��540型彩色圖像分析系統定量分析〔10〕，128×128像素點，每張切片隨機測5次，酶切片反應至少測30次，以陽性反應面積(單位為μm2)作為酶反應強度的參數，取其平均值。

　　1.6 統計學處理 實驗數據以x±s表示，應用SPSS 12.0統計軟件進行方差分析。

2 結 果

　　2.1 一般情況 大鼠受到運動病刺激后，自發活動明顯減少，皮毛蓬松聳立，排尿排便增多。運動病刺激結束后大鼠行為表現有所恢復，約3 h后開始活動或進食。與正常組比較，生姜組和模型組大鼠消瘦，進食量未見明顯改變。

　　2.2 各組大鼠大腦皮質三種酶活性 運動病大鼠大腦皮質Na+�睰+�睞TP酶、CCO陽性反應面積明顯減小，ALP陽性反應面積增大;生姜透皮貼使運動病大鼠大腦皮質中Na+�睰+�睞TP酶、CCO陽性反應面積明顯增大，ALP陽性反應面積減小，見表1。表1 大鼠大腦皮質三種酶活性的圖像定量分析(x±s，n=8)與正常組比較：1)P<0.05，2)P<0.01;與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

　　2.3 各組大鼠腦干前庭區三種酶活性 運動病大鼠腦干前庭區中Na+�睰+�睞TP酶、CCO陽性反應面積明顯減小，ALP陽性反應面積增大;生姜透皮貼使運動病大鼠腦干前庭區中ALP、Na+�睰+�睞TP酶、細胞色素氧化酶陽性反應面積明顯增大，ALP陽性反應面積減小，見表2。表2 大鼠腦干前庭區三種酶活性的圖像定量分析(x±s，n=8)

　　2.4 各組大鼠小腦皮質三種酶活性 運動病大鼠小腦皮質中Na+�睰+�睞TP酶、CCO陽性反應面積明顯減小，ALP陽性反應面積增大;生姜透皮貼使運動病大鼠小腦皮質區中ALP、Na+�睰+�睞TP酶、CCO陽性反應面積明顯增大，ALP陽性反應面積減小，見表3。表3 大鼠小腦皮質三種酶活性的圖像定量分析(x±s，n=8)

　　3 討 論

　　大腦和小腦皮質及腦干前庭區等中樞對運動病的發病有關〔11〕。ALP和Na+�睰+�睞TP酶反應產物主要定位于以上三部位毛細血管內皮細胞膜上，也呈陽性反應。CCO反應產物主要定位于以上三部位腦細胞線粒體膜上。核心期刊論文發表

　　旋轉刺激可引起神經細胞膜Na+�睰+�睞TP酶活性下降，ALP活性上升，線粒體CCO活性下降。這可能表明旋轉刺激引起Na+�睰+泵效率明顯下降，導致細胞膜外K+濃度上升，高濃度K+可打開神經細胞膜上電壓依賴性Ca2+通道，導致Ca2+內流。神經細胞膜外高K+和細