新型抗ErbB2、抗CD16三價雙特異性抗體的構建及功能鑒定

【摘要】  　　目的 構建一種新型三價抗ErbB2、抗CD16 BsAb。方法 構建重組載體pET22b(+)/BsAb；轉化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組蛋白的表達，通過包涵體復性純化蛋白。應用懸浮培養系統擴增穩定表達抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的CHO細胞株(CG5細胞)和穩定表達抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的CHO細胞株(HG2細胞)，通過rProtein A Sepharose Fast Flow親和層析柱純化融合蛋白，應用流式細胞術分析BsAb的結合能力。結果 該BsAb可在大腸桿菌BL21(DE3)中以包涵體形式高效表達，通過對重組蛋白的復性可獲得高純度的蛋白；復性后的BsAb具有與其親本抗體相似性的結合靶抗原的能力。結論 新型三價抗ErbB2、抗CD16 BsAb能與高表達ErbB2的乳腺癌細胞系SKBR3細胞高親和力結合和表達CD16的人外周血單個核細胞低親和力結合。

【關鍵詞】  雙特異性抗體 ErbB2 CD16 腫瘤免疫治療

　　ABSTRACT: Objective  To construct a novel trivalent anti-ErbB2/CD16 bispecific antibody. Methods  The recombinant plasmid pET22b(+)/BsAb was constructed. The recombinant protein was expressed in E.coli BL21 strain (DE3) and purified by refolding. By using Spinner System, CG5 cells, CHO cells stably expressing anti-CD16 scFv-Fc fusion protein and HG2 cells, CHO cells stably expressing anti-ErbB2 scFv-Fc fusion protein were expanded. The fusion proteins were purified over rProtein A Sepharose Fast Flow Column. The binding activity of the BsAb was analyzed by flow cytometry. Results  The BsAb was efficiently expressed in E.coli BL21 strain (DE3) as inclusion bodies. High purity of recombinant protein could be obtained by refolding. The BsAb possessed the capability of binding to the target antigens as its parental antibodies. Conclusion  The novel BsAb was able to bind human breast cancer cell line SK-BR-3 highly expressing ErbB2 and human peripheral blood mononuclear cells expressing CD16.

　　KEY WORDS: bispecific antibody; ErbB2; CD16; tumor immunotherapy

　　治療性抗體主要通過介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)和補體依賴的細胞毒性(complement dependent cytotoxicity, CDC)等機制實現對腫瘤細胞的殺傷［1-2］。目前已有多種抗體被批準用于腫瘤的臨床治療。然而，抗體的天然效應功能很弱，生理條件下血清中存在的高濃度IgG可與治療性抗體競爭結合效應細胞表面的Fc受體(Fc receptor, FcR)，從而影響了抗體的功能。因此，提高抗體的效應功能一直是抗體工程領域的重要發展方向［1-3］。

　　雙特異性抗體(bispecific antibody, BsAb)是一類具有雙親嗜性的組合抗體，具有結合兩種不同特異性抗原的功能。BsAb可同時與腫瘤細胞表面的腫瘤相關抗原和效應細胞表面的觸發分子結合，從而直接介導效應細胞對腫瘤細胞的殺傷。體內外實驗研究結果表明，BsAb可介導更強的抗腫瘤活性。然而，對10余種不同的BsAb的臨床實驗研究發現，BsAb雖然表現出一定的療效，但明顯的毒副反應影響了BsAb的治療劑量［4-5］。學術論文發表

　　抗體治療一般通過靜脈給藥，治療性抗體在循環中首先與效應細胞遭遇而結合于效應細胞。在抗體尚未到達靶部位之前，即可能引發效應細胞廣泛活化，導致細胞因子釋放綜合征［6-8］。另一方面，抗體很大程度上可能是由效應細胞攜至腫瘤局部，而并非在腫瘤靶部位招募效應細胞。這些問題給抗體研發工作者帶來了新的思考。

　　為了使抗體能快速到達腫瘤局部，提高局部效應細胞的密度，進而產生對腫瘤細胞的有效殺傷，減少毒副作用，抗體研究者曾提出，一個理想的BsAb應當具有能高親和力結合腫瘤細胞及單價觸發效應細胞的特性。我們在前期工作中構建了一個新型的三價BsAb。這個BsAb能夠與腫瘤靶抗原以雙價的單鏈抗體(single chain Fv, scFv)形式結合，而與表達CD16的效應細胞則以單價的Fab形式結合。由于該BsAb缺乏抗體Fc區，純化效率較低，從而影響了體內外活性研究的開展。為了克服BsAb的純化難題，我們對該抗體的表達及純化方案做了進一步的探索，獲得了BsAb在原核細胞中的高效表達，并純化得到可供體內外實驗用的足量蛋白。通過實驗證明，BsAb保留了良好的結合活性。

　　1  材料與方法

　　1.1  菌株、質粒和細胞

　　IgG1重鏈第一恒定區(constant region of heavy chain, CH1)和κ鏈恒定區(constant region of light chain, CL)基因由軍事醫學科學院生物工程研究所童貽剛博士提供(GenBank AF027159, X95747)；鼠抗人ErbB2 scFv cDNA由美國猶他大學藥學院Yu Lei博士提供；大腸桿菌菌株BL21(DE3)、原核表達載體pET22b(+)、穩定表達抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的CHO細胞株(CG5細胞)、穩定表達抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的CHO細胞株(HG2細胞)、人乳腺癌細胞系SKBR3細胞(ATCC No. HTB-30)為本室保存。

　　1.2  試劑和培養基

　　限制性內切酶為Biolab公司產品；AMV反轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、Wizard Purifection 質粒提取試劑盒為Promega公司產品；DNA片段回收試劑盒為北京鼎國生物技術公司產品；羊抗人IgG、辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG及人IgG購自北京中山生物技術公司；G418、TRIZOL總RNA抽提試劑、T4 DNA 連接酶購自GIBCO BRL公司；IPTG為Sigma公司產品；人淋巴細胞分離液為TBD公司產品；rProtein A Sepharose Fast Flow親和層析柱購于Amersham Bioscience公司；Spinner System 為IBS Integra Biosci