幽門螺桿菌尿素通道蛋白基因UreI載體的構建、融合表達及純化

【摘要】  　　目的 構建幽門螺桿菌(H.pylori, Hp)尿素通道蛋白基因UreI的融合表達載體，并在E.coli BL21中表達，為進一步研究UreI的功能奠定基礎。方法 利用分子克隆技術以Hp DNA染色體為模板，擴增Hp UreI基因片段，將目的基因UreI與載體pET32a(+)分別經kpnⅠ和HindⅢ雙酶切，純化，連接。篩選陽性重組載體，轉化大腸桿菌BL21，以IPTG誘導表達pET32a(+)/UreI融合蛋白。表達產物經Ni-NTA瓊脂糖樹脂純化后，用SDS-PAGE及Western blot分析。結果 經酶切、測序分析表明，插入的基因片段為Hp UreI編碼基因，由585 bp組成，與GenBank相應菌株HP AM417 609序列完全一致，無堿基突變。經SDS-PAGE分析顯示重組質粒pET32a(+)/UreI在原核細胞中得到了高效融合表達，其重組融合蛋白分子量為130 ku，經Ni-NTA瓊脂糖樹脂純化后，其純度達95%以上，Western blot分析顯示，該重組融合蛋白可被6-His鼠抗單克隆抗體所識別，具有良好的反應原性。結論 成功地克隆和構建了原核表達載體pET32a(+)/UreI，并在原核細胞中得到了高效融合表達。

【關鍵詞】  幽門螺桿菌 尿素通道蛋白(UreI) 原核表達

　　ABSTRACT: Objective  To construct the prokaryotic expression vector of the urea channel protein gene (UreI) of Helicobacter pylori and make it expressed in E.coli BL21. Methods  The target gene encoding UreI was amplified from Hp DNA by PCR, digested by restricted endonuclease enzyme of HindⅢ, KpnⅠ simultaneously, and inserted into prokaryotic expression vector pET32a(+) digested by corresponding restricted endonuclease enzyme. The recombinant plasmid was used to select and identify by restricted endonuclease enzyme digestion and sequence analysis and transform, meanwhile induce it to be expressed in E.coli BL21 by IPTG. The recombination fusion protein was purified by 6-His marked Ni-TEDTM kit and analysed by Western blot. Results  Restriction endonuclease analysis and sequencing showed that the target gene was found to be 585 base pairs and had been inserted into recombinant vector. As compared with gene HP AM417 609 reported by GenBank, cloned UreI gene sequence was completely matched and composed of 585 bp. SDS-PAGE analysis showed that the recombinant plasmid pET32a(+)/UreI could be expressed in E.coli BL21, its relative molecule mass of expressed product was 130 ku. After purified with Ni-NTA agarose resin, the purity of recombinant fusion protein was about 95%. Western blot results showed that the recombinant fusion protein could be identified by anti-6-His monocloned antibody, suggesting that this fusion protein has good reactionogenicity. Conclusion  The gene coding for UreI is cloned and expressed successfully.

　　KEY WORDS: Helicobacter pylori; urea channel protein gene (UreI); prokaryotic expression

　　幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)是上消化道疾病的主要致病菌，它的感染不但與B型胃炎和消化性潰瘍的發生有密切關系，而且與非潰瘍性消化不良、MALT淋巴瘤和胃癌的發生也有重要關系，并已被世界衛生組織列為胃癌等腫瘤發生的相關因素［1］。Hp在我國普通人群的感染率較高(50%-80%)，并仍以每年1%-2%速度增加［2］。目前認為Hp的免疫防治將是減少胃癌以及消化性潰瘍的最有效和最經濟的辦法。

　　幽門螺桿菌尿素通道蛋白(UreI)在Hp致病中起到了最為關鍵的作用。在酸性環境下，UreI激活尿素酶分解尿素產生氨，而氨的生成是Hp對抗胃酸、耐受胃酸以及在胃內定植的基礎，因此UreI是Hp在胃內定植最關鍵的一個環節［3］。Hp的持續感染與UreI有重要的關系，抑制UreI的表達，從而抑制尿素跨膜轉運，使Hp對酸不耐受，進而不能在胃內強酸環境中定居，達到根除Hp及其相關疾病的目的，因此以UreI為抗原的Hp疫苗將具有廣闊的應用前景。本文對Hp尿素通道蛋白UreI基因進行克隆，構建重組質粒pET32a(+)/UreI,并在E.coli中進行表達，為進一步研究UreI的功能奠定基礎。

　　1  材料與方法

　　1.1  菌株和質粒

　　Hp由本校微生物學教研室提供，DH5α菌株，BL21(DE3)表達菌和pET32a(+)載體為本校病毒性肝炎所保存。限制性內切酶HindⅢ、KpnⅠ及Tag DNA聚合酶購自TaKaRa大連公司，T4DNA連接酶購自Promega公司。柱離心式膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒購自Omega公司。鼠抗6-His單抗、羊抗鼠IgG-HRP購自北京中山公司。

　　1.2  基因組DNA的提取 護理論文發表

　　參考文獻報道［4］，取1.5 mL Hp培養物，12 000 r/min，離心2 min。取沉淀，加入567 μL的TE緩沖液，混懸。再加入100 g/L SDS 30 μL和20 g/L蛋白酶K 3 μL，于37 ℃溫育1 h。依次加入5 mol/L NaCl 100 μL和100 g/L SDS 80 μL，于65 ℃溫育10 min。用酚及酚/氯仿各抽提3次，收集上清液轉入EP管中，加入0.6倍于上清液的異丙醇，12 000 r/min，離心15 s。取沉淀，加入700 mL/L乙醇1 mL洗滌，再以12 000 r/min離心5 min。棄上清液，將沉淀溶于100 μL TE中，于-20 ℃保存備用。

　　1.3