反義寡核苷酸抑制人惡性黑素瘤A375細胞survivin mRNA及其蛋白的表達

【摘要】  　　目的 研究survivin反義寡核苷酸(ASODN)對人惡性黑素瘤A375細胞survivin mRNA及蛋白表達的影響。方法 人工合成survivin ASODN，脂質體介導轉染人惡性黑素瘤細胞株A375，采用原位雜交、免疫組化SP法檢測survivin mRNA及其蛋白表達的變化。結果 轉染24 h后，ASODN組A375細胞survivin mRNA表達較對照組顯著下調(P<0.01)；轉染48 h后，與對照組相比，ASODN組細胞的survivin蛋白水平顯著下降(P<0.01)。結論 Survivin ASODN可下調A375細胞survivin mRNA的表達和survivin蛋白水平。

【關鍵詞】  survivin 惡性黑色素瘤 反義寡核苷酸

　　ABSTRACT: Objective  To study the effects of survivin antisense oligodexynucleotide (ASODN) on the expression of survivin mRNA and its protein in human malignant melanoma cell line A375. Methods  Survivin ASODN was synthesized and transfected into melanoma cell line A375 by the liposome-encapsulation. Survivin mRNA and protein were detected by in situ hybridization and immunohistochemistry, respectively. Results  At 24h after the transfection, the expression of survivin mRNA was significantly lower in the ASODN group than in the control group (P<0.01). The expression of survivin protein was also significantly decreased in the ASODN group than in the control group at 48h after transfection (P<0.01). Conclusion  Survivin ASODN can down-regulate the expression of survivin mRNA and its protein in A375 cells.

　　KEY WORDS: survivin; malignant melanoma; antisense oligonucleotide

　　Survivin是新近發現的一種結構獨特的哺乳類凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein, IAP)，表達于人類大多數腫瘤組織，但是在正常成人組織不表達(胸腺除外)［1］，與腫瘤發生、發展及治療抵抗密切相關。在惡性黑素瘤皮損［2］及其細胞株中［3］都存在survivin過表達。本研究以survivin反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASODN)轉染體外培養的惡性黑素瘤細胞株A375，分別用原位雜交和免疫組化的方法檢測人惡性黑素瘤細胞survivin mRNA表達及其蛋白水平的變化，初步探討反義寡核苷酸的作用機制，為survivin ASODN治療惡性黑素瘤提供理論依據。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料 學術論文發表

　　人惡性黑素瘤細胞株A375購于第四軍醫大學口腔生物學教研室；Oligofectamine轉染試劑購自Invitrogen公司；Survivin原位雜交檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物公司；羊抗人survivin多克隆抗體sc-8806購自Santa Cruz公司；SP免疫組織化學試劑盒購自中山生物公司。

　　1.2  全硫代寡核苷酸設計、合成和修飾

　　Survivin反義寡核苷酸序列設計參照文獻［4］，由18個堿基組成，序列如下：5＇-TGTGCTATTCTGTGAATT-3＇。寡核苷酸的合成及全硫代磷酸化修飾均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

　　1.3  細胞培養

　　復蘇人源性惡性黑素瘤細胞株A375，用含10 mL/L胎牛血清RPMI-1640培養基培養，2-3 d傳代一次。

　　1.4  原位雜交測定survivin mRNA

　　將無菌蓋玻片放入24孔培養板，以4×104 /mL濃度接種細胞，6 h后各孔分別置換為不含血清的、含ASODN的試驗用培養液0.66 mL。ASODN的處理濃度設為20 μmol/L，脂質體終濃度為1 mL/L。實驗分ASODN處理組和空白對照組：①ASODN處理組，即試驗用培養液含20 μmol/L ASODN；②空白對照組，即不含血清的RPMI-1640培養液。在無血清條件下阻斷4 h后，各孔均加入含30 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養液0.34 mL，繼續培養24 h后，傾出培養液，40 g/L多聚甲醛固定，按試劑盒程序進行原位雜交檢測。每組測定3張切片，使用HPIAS-1000彩色病理圖文分析系統，隨機選取每張細胞片中不相重疊的400倍視野，共計數50個細胞，進行細胞陽性程度的測定，計算每組陽性細胞的平均染色灰度值，以確定細胞中survivin mRNA的相對含量。

　　1.5  免疫組化測定survivin蛋白的水平

　　細胞接種、分組和處理方法同原位雜交。進行4 h無血清阻斷，再培養48 h后，傾出培養液，冷丙酮固定，免疫組化按試劑盒程序進行。取未經復染的免疫組化染色結果進行圖像分析，利用HPIAS-1000彩色病理圖文分析系統，分析轉染前后人惡性黑色素瘤細胞中survivin蛋白表達的相對含量，每組選取3張切片，每張切片隨機選擇5個高倍鏡測量視野，計數50個細胞，由計算機給出平均光吸收數值。

　　1.6  統計學處理

　　數據均采用平均數加減標準差表示。應用t檢驗進行統計分析，顯著性差異取P<0.05。

　2  結 果

　　2.1  Survivin ASODN下調A375細胞survivin mRNA的表達

　　光鏡顯示對照組陽性細胞雜交信號位于胞漿，呈顆粒狀，棕黃色(圖1)。ASODN處理組胞漿中雜交信號與對照組比較明顯減弱(圖2)。說明轉染ASODN后細胞survivin mRNA的翻譯受到抑制。陰性對照結果均為陰性。用圖像分析系統對陽性染色的強度(灰度值)進行半定量測定，灰度值與陽性強度成反比，灰度值越小，染色越強。兩組細胞所測結果如表1所示。對照組平均灰度值為109.8±12.8，而ASODN處理組為188.6±8.2，兩組經獨立樣本t檢驗顯示差異有統計學意義(P<0.001)。表1  各組A375細胞survivin 原位雜交染色圖像分析的灰度值（略）

　　2.2  Survivin ASODN降低A375細胞survivin蛋白表達的水平
 
　　免疫組化染色顯示A375細胞survivin蛋白免疫陽性反應呈棕黃色，主要分布于胞漿。正常對照組陽性細胞染色較深(圖3)。而s