補腎益智湯對老年癡呆模型大鼠治療作用的實驗研究

【摘要】  　　目的觀察補腎益智湯對老年癡呆模型大鼠學習記憶和超氧化物歧化酶(SOD) 、丙二醛（ MDA）的影響。方法頸背部皮下注射D-半乳糖及側腦室注射Aβ25-35制作老年癡呆大鼠模型, 以低5［g/（kg·d）］、中10［g/（kg·d）］、高20［g/（kg·d）］3個劑量的補腎益智湯灌胃治療，通過八臂迷宮測試各組大鼠的學習記憶能力，采用比色法測定大鼠血清中SOD活力,MDA含量。結果高劑量補腎益智湯能顯著減少大鼠參考記憶錯誤（RME）（P＜0.05），對工作記憶錯誤（WME）有降低趨勢，但無顯著性差異；高劑量補腎益智湯能顯著提高大鼠血清中SOD活力 (P<0.01); 中、高劑量補腎益智湯能顯著降低大鼠血清中MDA含量 (P<0.01)。結論通過降低自由基水平可能是補腎益智湯治療老年癡呆模型大鼠的機理之一。

【關鍵詞】  補腎益智湯　老年癡呆模型　超氧化物歧化酶　丙二醛　學習記憶　大鼠

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of BushenYizhi decoction on learning memory,superoxide dismutase（SOD）and maleic dialdehyde（MDA） in Alzheimer's disease rats.  MethodsThe AD model of mice was established by the injection of Aβ25-35 into the lateral cerebral ventricle and  was given D—galactose, sc . low, middle, high(5,10,20g/kg·d)  doses of BushenYizhi decoction were orally administered.The learning  and memory  ability of the AD model rats were detected by 8-arm radial  maze test. The activity of SOD and the MDA  in serum were examined by colorimetric method.ResultsHigh dose of BushenYizhi decoction could decrease  reference  memory error(RME) in AD rats  ( P＜0.05）,reduce working  memory  error(WME),and  improve the activity of SOD (P<0.01). Middle and high doses of BushenYizhi decoction could decrease the content of MDA(P<0.01).ConclusionBy reducing the level of free radicals may be the mechanisms in treating Alzheimer's rats with Bushenyizhi decoction.

　　Key words： BushenYizhi decoction；  Alzheimer';  sdisease model； SOD；MDA；  Learning and memory；  Rats

    老年癡呆即“阿爾茨海默病”(Alzheimer’s Disease ，AD) 是一種進行性神經退行性疾病,伴有認知及行為障礙,多發生在中、老年人群中。隨著人口老齡化的加劇,AD 的發病率不斷升高,給社會和患者家庭帶來沉重負擔。因此,如何防治AD 日益成為研究熱點。由于AD 的病因病機尚未明確,所以目前對該病尚無特效藥物。中醫學具有悠久的歷史,其豐富的藥物種類為AD 治療藥物篩選提供了一個龐大的資源庫。補腎益智湯主要由熟地、生龜板、人參、山藥、黃精、牛脊髓、山茱萸、云苓、丹皮、澤瀉組成，該方具有滋補而不留邪、降瀉而不傷正，以補為主，泄中寓補的特點，體現了通過調節機體整體生理機能的平衡而發揮治療作用的科學指導思想。組方以補腎陰為基礎使腎精腦髓有源,據《素問·陰陽應象大論》：“形不足者,溫之以氣;精不足者,補之以味”,“陽為氣,陰為味 ”,故而該方主要以補腎陰為主。又因“人始生,先成精,精成而腦髓生”,可知腦為陰津物質所成,所以補腎填精,腎精充盛,腦髓得養,才能使智有生。該方已運用臨床多年,療效顯著。本次實驗通過觀察補腎益智湯對老年癡呆模型大鼠學習記憶、血清中超氧化物歧化酶、丙二醛的影響，以對補腎益智湯用于AD藥效學作用作出科學評價。

　　1  材料

　　1.1  動物Wistar大鼠，購自中國醫學科學院實驗動物研究所繁育場，許可證編號為SCXK（京）0089322，2004-0001。雌雄各半共72只，體質量200～250 g。

　　1.2  藥物和試劑 

　　補腎益智湯（熟地、生龜版、人參、山藥、黃精、牛脊髓、山茱萸、云苓、丹皮、澤瀉）以上藥物除牛脊髓（購自食品店）外均購自山西省中醫藥研究院，在山西省中醫藥研究院中心實驗室制成含生藥2 g/ml的水溶液，4℃冰箱保存。D-半乳糖：北京化工廠，批號070404，用時以無菌生理鹽水配成5%溶液；尼莫地平：天津市中央藥業有限公司，生產批號：070911，用時以蒸餾水配成0.075%混懸液；注射用青霉素鈉；華北制藥股份有限公司，批號：F0712102；Aβ25-35：美國Sigma公司，027k4797，臨用前將Aβ25-35溶于無菌生理鹽水中，終濃度為2 g/L，密封后置于37℃培養箱中144 h；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20081121；丙二醛（MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20080825。

　　1.3  儀器電熱恒溫水溫箱：HH–W21，上海醫用恒溫設備廠；旋渦混合器：FZQ—2，江蘇泰縣醫療器械廠制造；離心機: KDC–1044，科大創新股份有限公司中佳分公司；721分光光度計:上海第三分析儀器廠；腦立體定位儀:國營西北光學儀器廠；生化培養箱: LRH–150B，廣東省醫療器械廠；電子天平: BP-310S，德國塞多利斯；八臂迷宮分析測試儀：RM–200，成都泰盟科技有限公司。

　　2  方法

　　2.1  老年癡呆模型制備大鼠頸背部皮下注射D-半乳糖50 mg/(kg.d) ［1］,連續6周,第7周側腦室注射Aβ25-35［2］。大鼠戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉后，固定于腦立體定位儀上，頭頂部正中切口，暴露前囟，參照大鼠腦立體定位圖譜［3］，以前囟為參照點，在前囟點后1.3 mm,旁開2 mm將用5 ml注射針頭鉆一小孔，垂直插入10 μl微量注射器，深度4.0 mm（達側腦室），緩慢注射5 μl聚集態的Aβ25-35,注射時間持續10 min,留針5 min,注射完畢后，局部撒復方新諾明藥粉防止感染，縫合頭皮，術后肌肉注射青霉素每只5萬單位，連續4 d。對照組頸背部皮下注射等量生理鹽水，第7周側腦室注射無菌生理鹽水，操作同前。側腦室注射后，對照組存活11只大鼠，側腦室注射Aβ25-35后大鼠共存活56只。

　　2.2  動物分組及給藥側腦室注射后，除對照組外，造模動物隨機分為癡呆模型對照組（以下簡稱模型對照組）、尼莫地平片陽性對照組（以下簡稱尼莫地平組，15 mg/kg）、補腎益智湯低劑量組（5 g/kg）、補腎益智湯中劑量組（10 g/kg）、補腎益智湯高劑量組（20 g/kg）。術后第2天開始灌胃，按20 ml/kg灌胃量計算，1次/d，對照組和模型組給予等量蒸餾水，連續6周。

　　2.3  八臂迷宮行為學測定灌胃第6周開始八臂迷宮訓練［4］，放射狀八臂（四臂放食物）是一種經典的測定動物空間記憶的方法，它可以同時檢測動物的參考記憶和工作記憶。迷宮中央區直徑30cm,向四周以等角度和等長度延伸八條臂。訓練前大鼠先在迷宮中適應1 d，適應時3至4只大鼠同時置于迷宮中，自由活動和攝取食物10 min。適應后進行每1次的訓練。每次訓練時，八臂中只有四臂放置了食物（分別為3，5，6和8臂），整個實驗過程均維持此順序。大鼠放在迷宮中央區，此時中央區四周用門關住15 s將門打開，大鼠可選擇進入任意一臂，以攝取食物。大鼠進入有食物的臂且攝取了食物為1次正確選擇，否則為錯誤選擇。記錄參數為錯誤選擇的次數。重新進入放食物臂稱為工作記憶錯誤（working  memory  error,WME）,進入不放食物臂稱為參考記憶錯誤(reference   memory   error,RME)。連續5次訓練，第6次正式檢測。

　　2.4  大鼠血清中SOD活力、MDA含量檢測八臂迷宮檢測后，停食12 h，烏拉坦（0.8 g/kg）腹腔注射麻醉，背位固定，沿腹正中線切開，下腔靜脈取血，分離血清，按SOD試劑盒說明書測定血清超氧化物歧化酶；按MDA試劑盒說明書測定血清丙二醛。
　　2.5  統計分析

　　數據用±s表示,組間比較采用t檢驗，P＜0.05有統計學意義。

　　3  結果

　　3.1  行為學(八臂迷宮試驗) 測定模型對照組大鼠參考記憶錯誤（RME）與對照組比較顯著升高（P＜0.05），工作記憶錯誤（WME）與對照組比較有升高趨勢，但無顯著性差異。高劑量補腎益智湯顯著減少癡呆模型大鼠參考記憶錯誤（RME）（P＜0.05），對工作記憶錯誤（WME）有降低趨勢，但無顯著性差異，（見表1）。結果表明補腎益智湯對老年癡呆模型大鼠學習記憶障礙有明顯改善作用，能提高學習記憶力。表1  補腎益智湯對AD大鼠學習記憶的影響 （略）

　　3.2  補腎益智湯對老年癡呆模型大鼠血清中SOD、MDA的影響

　　模型對照組大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活力與對照組比較有降低趨勢，血清丙二醛（MDA）與對照組比較含量升高（P<0.05）。低、中劑量補腎益智湯有升高模型鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活力的趨勢，高劑量補腎益智湯顯著升高模型鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活力（P＜0.01）；低劑量補腎益智湯有降低模型鼠血清MDA含量的趨勢，中、高劑量補腎益智湯顯著降低模型鼠血清MDA含量（P＜0.01），（見表2）。結果表明補腎益智湯能提高老年癡呆模型大鼠血清中超氧化物歧化酶活力，從而增強機體清除氧自由基的能力，減少丙二醛（MDA）的生成。表2   補腎益智湯對AD大鼠血清中MDA、SOD的影響（略）

　　4  討論

    研究證實D–半乳糖衰老模型具有與人類自然衰老相似的生化改變、免疫功能低下、基因表達與調控異常、細胞生長繁殖能力下降、細胞退行性改變及認知障礙［5］等表現。β–淀粉樣蛋白(Aβ)是各種原因誘發AD的共同通路，是AD形成和發展的關鍵因素［6］。動物實驗中已經得到證明［7～9］在腦室、海馬、中隔或杏仁核等與學習記憶有密切關系的腦區注入Aβ25-35均可導致明顯的學習記憶能力下降。

    老年癡呆多發生在中老年人群中，其發病與機體衰老狀態密切相關。氧自由基損傷理論是衰老的主要學說之一。腦組織是體內氧負荷最大的器官之一, 是與衰老相關性很高的組織。Benzi 等［10］報道了氧自由基在衰老和AD 中的重要作用, 指出腦組織中含高濃度不飽和脂肪酸、兒茶酚胺, 是氧自由基最易侵襲的靶器官, 而腦內保護性抗氧化酶和非酶性自由基清除劑含量卻很低, 同時發現AD 患者腦的神經纖維纏結中有血紅素氧化酶-1、Cu-Zn-SOD, 說明氧自由基與神經纖維纏結形成有關, 表明氧自由基參與了AD 的病理過程。
    　 
　　研究認為,氧自由基引發脂質過氧化反應,而脂質過氧化物的細胞毒性作用,在神經元變性死亡,導致老年性癡呆的發生發展中占有重要地位。抗過氧化藥物通過不同途徑清除自由基,可防止組織過氧化損傷,延緩癡呆病情的惡化,藥物抗氧化作用對老年性癡呆的效果,主要取決于到達腦組織的藥物有效成分多少［11～13］。超氧化物歧化酶（SOD）對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷，SOD活力的高低間接反應了機體清除氧自由基的能力。 MDA為脂質過氧化產物，其產生量與自由基量相平行，因而測定其可反映自由基的水平，間接反映出細胞損傷程度。

    祖國醫學認為, 腎與腦緊密相關。認為頭者精明之府, 腦為髓之海, 腎藏精生髓。若腎虧髓枯, 腦失所養, 則出現記憶、智能、精神等方面的障礙, 進而影響全身的生理功能。李紅梅等［14］之前曾實驗研究本方發現補腎益智湯在體外對神經元的生長和突起有促進作用。本次實驗結果提示，補腎益智湯可提高模型鼠血清中SOD活力，降低模型鼠血清中MDA含量，并對AD大鼠學習記憶障礙具有改善作用。因此，補腎益智湯可能是通過降低自由基水平防止組織過氧化損傷，減少自由基對神經元的損傷，從而達到治療作用。

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