抑癌湯對人肺癌NCI-H446細胞增殖抑制作用的體外實驗研究

【摘要】  　　目的通過自擬方抑制癌湯對人肺癌NCI-H446細胞株進行干擾研究，探討其增殖抑制作用。希望從苗藥中藥組方中找到抑制肺癌細胞增殖的新方法。方法將NCI-H446細胞進行培養，繪制NCI-H446細胞生長曲線，取處在對數生長期的NCI-H446細胞進行實驗。首先確定抑癌湯的作用濃度范圍。取細胞的存活率為50%時的藥物濃度范圍作為抑癌湯的給藥濃度參考。再將抑癌湯在該濃度范圍內分為5個濃度組；實驗分抑癌湯組、西藥組、抑癌湯加西藥組、空白組四組、每一組各4個復孔，進行對照研究。結果抑癌湯對NCI-H446細胞毒實驗得到細胞存活率50%時的藥物濃度范圍在1～100 μg/ml之間。抑癌湯加西藥組優于抑癌湯組；抑癌湯加西藥組優于西藥組；西藥組優于抑癌湯組；抑癌湯組優于空白組；抑癌湯加西藥組優于空白組；西藥組優于空白組。結論抑癌湯在體外對人肺小細胞肺癌NCI-H446細胞具有抑制作用，具有潛在藥用價值，值得進一步深入研究。

【關鍵詞】  自擬方　抑癌湯　 肺癌　 NCI-H446細胞株　 增殖抑制作用

    原發性支氣管肺癌（primary bronchogenic carcinoma）腫瘤細胞起源于支氣管粘膜或腺體，是最常見的肺部原發性惡性腫瘤。目前肺癌中醫治療主要用于以下幾個方面：①對于分化較好的非小細胞肺癌不能手術或術后、放療后復發者，單用中醫藥治療可獲比放、化療較好的效果；②配合手術、放化療，起到減毒增效作用，即減少毒副反應，提高療效；③晚期肺癌西醫無特殊治療者，應用中醫藥可改善癥狀，提高生存質量，延長生存期，并在抗復發轉移方面有一定的優勢。苗族醫藥是苗族人民在長期生產和生活實踐中與疾病作斗爭的經驗總結和智慧結晶。苗醫藥認為癌是由于致癌惡毒引起細胞異常增生和變性的惡毒病癥。為了從中藥、民族藥中尋找能抑制肺癌腫瘤細胞增殖的藥物，我們開展由中藥、苗藥組成的抑癌湯對人肺癌NCI-H446細胞株進行干擾研究。現報道如下。

　　1  材料

　　1.1  苗藥中藥處方八月扎20 g，白花蛇舌草20 g，半枝蓮20 g，三尖杉20 g，白英20 g，石見穿20 g 。

　　1.2  陽性對照藥物金喜素（注射用鹽酸托泊替康）， 貴州漢方制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20000428   規格：2 mg/瓶。

　　1.3  人肺小細胞肺癌NCI-H446細胞株人肺小細胞肺癌NCI-H446細胞株購買于南京凱基生物科技發展有限公司， 培養要求：貼壁培養：
   
　　培養基：RPMI-1640 +10%小牛血清+1%雙抗

    消化液：0.25%胰蛋白酶

    凍存液：胎牛血清：DMSO=9：1

    培養條件：二氧化碳培養箱：5%CO2，37℃

　　2  方法

　　2.1  給藥方法

　　2.1.1  苗藥中藥組方煎煮和滅菌方法首先將待煎的藥物用冷水浸泡30    min，加水以浸泡后淹沒藥材2～3 cm為度。稱取藥物重量約120 g，使用砂鍋煎煮。煎煮用武火煎至微沸，再用文火煎煮，煎煮時間是以文火煎煮時間考察的，煎煮30 min。為了充分利用藥材，避免浪費，更好發揮藥效，煎煮兩次。煎煮時應當注意攪拌。再將兩次煎煮好的湯藥倒在一起，進行濃縮。將濃縮好的抑癌湯經過紗布、濾紙過濾，得到湯藥約120 ml。即得到抑癌湯生藥濃度為1g/ml。再經過高壓消毒鍋滅菌，4℃冰箱存放備用。

　　2.1.2  金喜素（注射用鹽酸托泊替康）人體每日用量：1.2 mg/m2

　　2.2  人肺小細胞肺癌NCI-H446細胞的培養

　　2.2.1  細胞鑒定對收到的細胞株進行鑒定，由專職病理老師在倒置顯微鏡下觀察鑒定，并結合南京凱基生物科技發展有限公司提供的細胞資料，鑒定為NCI-H446細胞株。

    細胞株收到后，細胞培養瓶完好無損，培養液無外滲，培養液無混濁。在倒置顯微鏡下觀察細胞密度，匯合度約為60%，未達到細胞傳代要求的匯合度80%的要求，將培養瓶中培養液吸出，留10 ml培養液繼續培養，細胞形態呈現圓形或梭性。過了2 d后細胞匯合度超過80%后，按細胞傳代要求進行傳代。
   
　　細胞高度惡性，未分化。癌細胞體積小，核圓形和卵圓形，癌細胞胞漿少，核漿比例明顯增大，核外形不規則，核分裂多見，癌細胞界限不清。

　　2.2.2  細胞傳代繼續培養細胞，直到細胞匯合度達到細胞傳代為80%的要求時，進行細胞傳代。在NCI-H446細胞瓶內加入0.25%胰蛋白酶，消化3～6 min，加入培養基吹打，制作成細胞懸液按1∶2傳代。

    按細胞培養條件進行傳代，經過3次傳代培養后，細胞一共有8瓶。細胞形態呈現圓形或梭性，將其中4瓶凍存。將2瓶用于后續實驗，另外2瓶繼續傳代培養。

　　2.3  細胞生長曲線繪制

　　2.3.1  細胞加樣計算細胞濃度2次，得出細胞濃度平均值。然后將細胞懸液等量的加入培養板的每個孔中，每天觀察4個孔，培養時間計為7 d。

　　2.3.2  觀察指標每隔24 h吸去4個孔的培養液，加入消化液，混懸細胞，計數細胞數目。每個孔計數2次，得出細胞濃度平均值。

　　2.3.3  繪制細胞生長曲線橫坐標為培養時間，縱坐標為細胞濃度，繪制細胞生長曲線。細胞倍增時間約為26 h。結果見圖1。

　　2.4  細胞增殖抑制實驗

　　2.4.1  細胞加樣取對數生長期的細胞，將細胞制成細胞懸液，再將細胞懸液加入細胞計數板進行計數，配制為5 000個/ml細胞濃度，將其接種細胞培養板。96孔細胞培養板每孔100 μl，放入37℃，5%CO2培養箱繼續培養。

　　2.4.2  加藥方法細胞加樣后經過24 h培養，從二氧化碳培養箱中取出96孔細胞培養板，在通過倒置顯微鏡觀察細胞形態，確定細胞生長良好后，按實驗分組用取樣器每孔加入相應液體各5 μl。每組4個復孔。

　　2.4.3  檢測方法再經過24 h培養后，在96孔細胞培養板中加入MTT溶液10 μl,繼續培養4 h。吸去培養液，加入與培養液相同量的DMSO。然后振蕩10 min，使結晶充分溶解。在酶聯免疫檢測儀上測定光吸收值。

　　2.4.4  實驗分組根據抑癌湯細胞毒實驗求出的抑癌湯IC50值，得出抑癌湯的IC50值所在的給藥濃度范圍。本實驗IC50值所在的給藥濃度范圍在1～100 μg/ml之間。因此實驗分組如下：

    抑癌湯組：取抑癌湯組的中間濃度（60 μg/ml）；
   
　　抑癌湯加西藥組：取抑癌湯組的中間濃度（60μg/ml）并加用西藥；
 
　　2.4.5  觀察指標 在酶標儀上測定光吸收值，測定波長為490 nm，測定OD數值。并進行形態學觀察。

　　2.4.6  繪制細胞增殖抑制實驗圖表細胞存活率（%）=實驗組光吸收值/對照組光吸收值×100%，對照組為只加等量的細胞培養液而不加任何藥物。細胞增殖抑制率（%）=(1-細胞存活率)×100%。以時間為橫軸，以細胞增殖抑制率為縱軸，繪制細胞增殖抑制實驗圖表。

　　2.5  實驗條件控制全部實驗在遵義醫學院中心實驗室完成，細胞培養及相關檢測在其細胞培養室完成。

　　2.6  統計學處理方法方差分析兩兩差異比較用LSD-t檢驗［2］，兩者間比較用均數比較。統計學軟件應用Microsoft Excel2000進行統計分析。

　　3  結果

　　3.1  不同濃度抑癌湯對NCI-H446細胞的增殖抑制作用人小細胞肺癌NCI-H446細胞在20，40，60，80，100 μg/ml的5個濃度上，癌細胞呈現出相應的變化：即隨著抑癌湯藥物濃度的增高癌細胞數量明顯減少。NCI-H446細胞在低濃度20 μg/ml時，細胞數量最多癌細胞被相互積壓而呈現出變形狀態。NCI-H446細胞在較高濃度80 μg/ml時，癌細胞呈卵圓形，梭形；核大、胞漿少；核仁不明顯，核分裂不明顯。NCI-H446細胞在較高濃度100 μg/ml時，細胞數量繼續減少，癌細胞呈結構不清。

　　3.2  同濃度抑癌湯對NCI-H446細胞的增殖抑制率

    抑癌湯在20，40，60，80，100 μg/ml各濃度和在24，48，72 h這3個觀測時間點與空白組（培養基對照組）比較均有統計學差異。
   
　　抑癌湯組3次重復實驗經過統計分析得到：P=0.492，即抑癌湯組3次重復實驗無統計學差異，說明實驗具有可重復性。結果顯示不同濃度抑癌湯作用48 h對NCI-H446細胞的增殖具有明顯的抑制作用，隨著作用時間的延長抑制作用逐漸減弱，且隨著給藥劑量的增大，抑制作用增強。抑癌湯在24 ，48，72  h的抑制率分別達到53.47%，54.47%和10.45%。3次實驗的抑癌湯的最高抑制率分別達到54.47%，53.2%和46%。表1   抑癌湯對NCI-H446細胞的增殖抑制作用(略)表2   給藥組抑制率數據(略)

　　3.3   四個給藥組（抑癌湯組、抑癌湯加西藥組、西藥組、空白組）之間的比較

　　3.3.1  細胞形態學觀察抑癌湯組選用的中間濃度（60 μg/ml）。人小細胞肺癌NCI-H446細胞在4種不同給藥方式作用下呈現不同細胞形態。其中抑癌湯加西藥組在48 h觀察點上效果最明顯，細胞核完全固縮，核溶解，細胞輪廓難以辨認；其次是西藥組，細胞呈現出細胞核固縮，核溶解，細胞輪廓勉強可以辨認；再次是中藥組，細胞呈現出偶爾有細胞核固縮，細胞輪廓清楚，細胞數量最多癌細胞被相互積壓而呈現出變形狀態，癌細胞呈卵圓形，梭形但不規整；空白出細胞存活狀態良好，核大、胞漿少；核仁不明顯，核分裂活躍，只是偶爾有衰老細胞增多。

　　3.3.2  不同給藥方式對NCI-H446細胞的增殖抑制率

    抑癌湯組選用的中間濃度（60 μg/ml）。抑癌湯加西藥組與抑癌湯組；抑癌湯加西藥組與西藥組；抑癌湯組與西藥組；抑癌湯組與空白組；抑癌湯加西藥組與空白組；西藥組和空白組的細胞抑制率有統計學差異。

    通過給藥組間均數兩兩比較：抑癌湯加西藥組優于抑癌湯組；抑癌湯加西藥組優于西藥組；西藥組優于抑癌湯組；抑癌湯組優于空白組；抑癌湯加西藥組優于空白組；西藥組優于空白組并有統計學差異。

　　4  討論

    原發性支氣管肺癌（primary bronchogenic carcinoma）簡稱肺癌（lung cancer）。腫瘤細胞起源于支氣管粘膜或腺體，是最常見的肺部原發性惡性腫瘤［3］。在我國城市人口中，肺癌的死亡率已由第四位躍居為各種腫瘤的首位，農村中上升最快的也是肺癌。肺癌的歷史只有五百余年。1420年在德國薩克森的一座礦山發現了首例肺癌。1875年在痰中首次見到癌細胞［4］。有專家預言：如果不能有效地控制吸煙和空氣污染，到2025年我國每年的肺癌人數將超過100萬，成為世界第一肺癌大國［5］。就臨床角度而言，肺癌可分為兩類：即小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。其中小細胞肺癌大約占肺癌的25%。由于癌組織迅速擴散，絕大多數患者失去外科手術切除的機會，臨床過程一般不超過3個月。而腫瘤細胞的特征之一是異常增殖，抑制腫瘤細胞的增殖是治療腫瘤的途徑之一，也是抗腫瘤藥物的基本要求。

    在祖國醫學中雖然無肺癌這一病名，但文獻中描述的“肺積”的臨床表現與肺癌較為相似，可以歸于“咳嗽”“痰飲”“肺積”“咯血”等病證的范疇。其主要的臨床表現：上氣咳嗽，喘促胸痛，咳痰咯血，胸悶氣急，發熱口干，氣短乏力，腰酸腿軟，畏寒怕冷［6］ 。隨著中醫學理論的日臻完善和臨床經驗的不斷積累，現已逐漸探索并形成了一門新的醫學學科——具有較為完整理論體系和辨證論治規范的中醫腫瘤學［7］。目前肺癌中醫治療主要用于以下幾個方面：①對于分化較好的非小細胞肺癌不能手術或術后、放療后復發者，單用中醫藥治療可獲比放、化療較好的效果；②配合手術、放化療，起到減毒增效作用，即減少毒副反應，提高療效；③晚期肺癌西醫無特殊治療者，應用中醫藥可改善癥狀，提高生存質量，延長生存期［8］ ，并在抗復發轉移方面有一定的優勢［6］ 。

【參考文獻】
  　�。�1］章靜波.組織和細胞培養培養技術［M］.北京:人民衛生出版社,2002：111.
　　
　�。�2］劉剛.Excel在統計分析中的應用［M］.北京：人民衛生出版社，2002：170.

　�。�3］熊 敏,吳一龍.現代肺癌病理與臨床［M］.北京:科學出版社,醫學出版分社,2003：86.

　�。�4］王吉耀.內科學［M］.北京:人民衛生出版社,2005：112.

　�。�5］徐振曄,楊宇飛.肺癌中西醫綜合治療［M］.北京:人民衛生出版社,2002：2.

　�。�6］陳銳深.現代中醫腫瘤學［M］.北京:人民衛生出版社,2003：1，3.

　　［7］王永炎.中醫內科學［M］.上海:上�？茖W技術出版社,1997：91.

　�。�8］辛 海.肺癌的中醫臨床治療進展［J］.Beijing Journal of TCM，2003，22（6）：50.