【摘要】 目的 觀察電針內關穴對大鼠心肌缺血再灌注損傷的NO、NOS與baX的影響。方法 在鼠冠狀動脈左前降支根部穿線置一硅管結扎左前降支，
制作心肌缺血再灌注損傷，檢測大鼠NO、NOS與baX的水平。結果 模型組心肌總NOS活性顯著低于假手術組（P＜0.05），電針內關組心肌總
NOS活性顯著高于模型組（P＜0.01）及電針列缺組和電針合谷組（均為P＜0.01），電針列缺組和電針合谷組心肌總NOS活性與模型組比較雖有升
高，但差異無顯著性意義（P＞0.05），表明電針內關可使心肌局部NOS活性升高。
NO和NOS在心肌缺血再灌注中起著重要的作用[1]。 NO是一種生物活性分子，主要由血管內皮細胞（VEC）合成，通過增加細胞內的環磷酸鳥苷（CGMP）而發揮廣泛的生物作用。NO不僅參與了對冠脈血管舒 縮的調控，維持有效的冠脈循環血流，而且對缺血后心肌的轉歸及心肌功能的恢復可能起著重要的作用，當心肌發生MIRI損傷時，明確缺血心肌處NO變化規律及 NO對心肌功能的影響有著重要的臨床意義。NOS為一含鐵的單氧化酶，主要分布于血管內皮細胞、N細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等細胞內，可催化左旋精氨酸 轉化為瓜氨酸和NO[2]。心肌組織內的NOS同功酶有兩種：原生型（cNOS）和誘生型（iNOS），cNOS主要由血管內皮細胞產生；iNOS主要產 生于巨噬細胞中[3]。baX是bcl-2家庭中的一員，起著促進細胞調節的作用[4]，采用免疫組織化學方法來分析調節細胞基因的表達已受到人們的高度 重視，并被廣泛應用于科研及臨床研究中。近年來大量實驗和臨床研究均證實，針刺心包經內關穴對缺血心肌具有明顯的保護作用，而降低缺血再灌注損傷程度，有 效保護心肌也一直是國內外醫學界十分關注的課題。本項研究通過觀察電針內關對心肌缺血再灌注損傷大鼠NO、NOS及凋亡調控基因baX的影響，試圖闡明電 針內關抑制心肌缺血再灌注損傷的作用機制。
1 材料與方法
1.1動物與分組
Wistar大鼠50只，體重250-300g，雄性，由湖南中醫藥大學動物中心提供。將50只動物隨機分為5組：假手術組、缺血再灌注模型組、針刺內關治療組、針刺列缺對照組、針刺合谷對照組，每組10只動物。
1.2實驗方法
10% 烏拉坦（1ml/100g）腹腔注射麻醉，行插管，接動物人工呼吸機，于第三、四肋間隙處開胸，暴露心臟，冠心動脈左前降支根部穿零號醫用縫合線，心電圖 監測，穿線處置一硅膠管結扎左前降支，以左室前壁發紺并向外膨脹及心電圖及S-T段抬高為標志，關閉胸腔，40min后開胸，剪開硅膠管，恢復左前降支灌 流，60min后，取靜脈血，摘取心臟。
假手術組：冠狀動脈左前降支根部穿線后，心電圖監測，記錄120min內心電圖S-T段變化，取靜脈 血，摘取心臟。缺血再灌注模型組：左冠狀動脈前降支根部穿線后，心電圖監測，結扎左前降支40min，再灌注60min后，取靜脈血，摘取心臟。電針內關 治療組、電針列缺對照組、電針合谷對照組：冠狀動脈左前降支根部穿線后，心電圖監測，關閉心電圖機，電針穴位20min，去電針，心電圖監測，結扎左前降 支40min，電針穴位20min，再灌注60min后，取靜脈血，摘取心臟。
1.3針刺方法
“內關”和“合谷”穴定位參照《中國針 灸匯萃•獸醫針灸卷》標準穴位圖譜；“列缺”穴定位采取擬人比照法，電針用G6805電針儀，疏密波刺激（疏波30Hz，密波100Hz），強度 6-15V，進針深度0.5cm左右，針刺“內關”、“合谷”、“列缺”組均將負極接兩側穴位，正極接鼠尾，以前肢出現輕微顫動為度。
1.4觀察指標與檢測方法
1.4.1 心肌一氧化氮（NO）檢測 摘取心臟，置于冰冷的生理鹽水中沖洗，除去血液，濾紙拭干，分析天平稱取0.2g心肌組織，放入小燒杯內，用刻度吸管加入組 織塊重量9倍的生理鹽水，眼科小剪剪碎組織塊，倒入玻璃勻漿管中，置于勻漿機上，搗桿垂直插入管中，上下轉動研磨40-50次，制備成10%的組織勻漿 液，倒入離心管中，350rpm常溫離心15min，取10%心肌組織勻漿上清液0.5ml，按一氧化氮試劑盒檢測步驟，用754紫外分光光度計測定。
1.4.2 心 肌一氧化氮合酶（NOS）活性檢測 取組織勻漿上清液100ul，加入底物緩沖液200ul，促進劑10ul，顯色劑100ul，37℃水浴準確反應 15min，加入透明劑100ul，終止液2000ul，混勻。754紫外分光光度計，蒸餾水調零，530nm處，1cm光徑比色測吸度A值，以雙縮脲法 測定其組織蛋白含量。
1.4.3 baX蛋白含量測定 采用免疫組化測定，動物再灌注60min后，摘取心臟，取結扎下方左心室肌，大小 1cm×0.8cm×0.3cm，10%中性福爾馬林固定，經處理制成蠟切片，PBS沖洗，加過氧化酶阻斷溶液，室溫孵育，PBS沖洗，抗原修復，加第 一、第二抗體，鏡下觀察，蘇木素復染，常規分化（脫水、透明、中性樹膠封片，試劑盒均由福建邁新生物技術開發公司提供）。
1.5統計方法
各組數據均以“x-±s”表示，采用統計軟件SPSSll.10進行數據處理，其差異顯著性檢驗采用方差分析，組間比較若方差齊時選用CSD法；方差不齊時用DunnetT3法。
2 結果
2.1各組NO及NOS的影響結果
模 型組心肌NO含量與假手術組相比，有降低趨勢，但差異無顯著性意義(P＞0.05),可能與手術外傷的應激性及樣本數偏少有關。電針內關組與模型組相比， 電針內關組心肌NO含量顯著高于模型對照組(P＜0.05)，且電針內關組與列缺組相比，心肌NO含量也高于列缺組。而電針列缺組和電針合谷組心肌NO含 量雖有升高，但與模型組相比差異無顯著性意義(P＞0.05)。以上結果提示，電針內關可使心肌缺血再灌注后心肌局部NO含量升高。
與此同時， 由表1可見,模型組心肌總NOS活性顯著低于假手術組（P＜0.05)，電針內關組心肌總NOS活性顯著高于模型組（P＜0.01)，及電針列缺組和電針 合谷組（P＜0.01)。電針列缺組和電針合谷組心肌總NOS活性與模型組比較雖有升高，但差異無顯著性意義（P＞0.05)，表明電針內關可使心肌局部 NOS活性升高。
表1 電針內關穴對心肌細胞NO及NOS變化的比較（x-±s)
組別 例數 NO(Umol/gprot) NOS(u/mgprot)
假手術組 10 311.25±70.4 37.8＜5.28
模型組 10 270.21±72.26 30.98＜3.77
內關組 10 379.54±56.02** 42.98＜3.42**
列缺組 10 306.21±61.65 33.07＜7.79
合谷組 10 322.93±75.74 33.79＜8.19
F值 3.198 5.518
P值 ＜0.05 ＜0.01
注：與模型組比較*P＜0.05，*** P＜0.01；
與列缺組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；
與合谷組比較# P＜0.05。
2.2各組baX蛋白表達比較
心 肌細胞中baX蛋白的表達位于胞質內，呈棕黃色。缺血再灌注模型組陽性率增高，與假手術組比較有顯著差異(P＜0.01)；內關組陽性率明顯減少，與模型 組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)；列缺組、合谷組陽性率與模型組比較無顯著性差異(P＞0.05),見表2。
表2 各組大鼠baX蛋白表達灰光度的比較（x-±s）
組別 例數 baX
假手術組 8 129.72±43.90**
模型組 8 81.64±33.27ΔΔ
內關組 8 115.51±32.45**
列缺組 7 85.05±39.30ΔΔ
合谷組 8 88.05±43.67ΔΔ
注:與假手術組比較ΔΔP＜0.01；與模型組比較**P＜0.01。
3 討論
內關穴為心包經絡穴，又為八脈交會穴，通于陰維脈，《難經·二十九難》曰：“陰維為病苦心痛。”內關的穴位特性決定了它主治的病征。該穴為人身五大重要穴之一，長期以來一直是治療心胸疾病的首選穴位。
有實驗發現，內源性NO可保護心肌缺血再灌注時心肌損傷，而給予NO的抑制劑則可擴大心肌梗死面積[5]。NO還是內皮細胞分泌的血管舒張因子的重要組成成分，具有舒張血管、降低血壓、抑制平滑肌增殖和血細胞粘附、浸潤等重要生理作用。
bcl- 2和baX是bcl-2大家族中的兩個重要成員，研究證實兩者對凋亡細胞起著截然不同的調節作用。Misao等[6]對急慢性心肌梗死患者心肌組織進行免 疫組化檢測發現，bcl-2在急性梗死周圍的非梗死區表達增加，而對照組和陳舊性梗死心肌細胞無bcl-2表達，但baX則主要在陳舊性梗死附近心肌表 達，認為bcl-2的表達和baX的過度表達在缺血再灌注后心肌細胞凋亡的保護和促進中起著重要的病理生理作用。
通過免疫組化染色顯示，電針內 關穴對由于缺血再灌注損傷引起細胞凋亡的調控基因baX蛋白基因有抑制作用[7]。電針內關穴對由于缺血再灌注損傷引起細胞凋亡的調控基因bcl-2有促 進作用。通過baX在各組大鼠心肌組織中的表達陽性率的比較，充分說明電針內關穴對心肌細胞的保護作用。
參 考 文 獻
[1]Dimerman TL，Lowenstein CJ. Snvder SH Molecular mechanisms of nitric oxidc regulation[J]. Cir Res 1993，73:217-222.
[2]林麗娜，王萬鐵，李東.一氧化氮合酶在家兔心肌缺血再灌注損傷中的作用[J].浙江醫學，1999，21(11):655.
[3]崔世濤，朱洪生.心肌缺血再灌注損傷中一氧化氮合酶及其基因異常表達的研究[J].中華醫學雜志，1998，18(5):327.
[4]朱國萍，婁陽，徐沖.bcl-2蛋白家族與細胞凋亡[J].細胞生物學雜志,2001,23(1):20-23.
[5]Williams MW, TaftCS, Ramnauth S, et al. Endogenous nitic oxide(NO) protects against: schaemia- reperfusion injury in the rabbit. Cardiovasc Res，1995，30(1):79-86.
[6]Misao J, Hayakana Y, Ohno M, et al. Expression of bcl-2 protein, an inhibitor of apoptosis, and bax, an accelerator of apoptosis, in ventricular myocytes of human hearis with myocard:al infarction[J]. Circulation, 1996,94(7):1 506-1512.
[7]林亞平，嚴潔，王超，等.電針內關對心肌缺血再灌注損傷大鼠cTnT及baX基因表達的影響.湖南中醫學院學報，2006,26(2)：40-42
NO和NOS在心肌缺血再灌注中起著重要的作用[1]。 NO是一種生物活性分子，主要由血管內皮細胞（VEC）合成，通過增加細胞內的環磷酸鳥苷（CGMP）而發揮廣泛的生物作用。NO不僅參與了對冠脈血管舒 縮的調控，維持有效的冠脈循環血流，而且對缺血后心肌的轉歸及心肌功能的恢復可能起著重要的作用，當心肌發生MIRI損傷時，明確缺血心肌處NO變化規律及 NO對心肌功能的影響有著重要的臨床意義。NOS為一含鐵的單氧化酶，主要分布于血管內皮細胞、N細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等細胞內，可催化左旋精氨酸 轉化為瓜氨酸和NO[2]。心肌組織內的NOS同功酶有兩種：原生型（cNOS）和誘生型（iNOS），cNOS主要由血管內皮細胞產生；iNOS主要產 生于巨噬細胞中[3]。baX是bcl-2家庭中的一員，起著促進細胞調節的作用[4]，采用免疫組織化學方法來分析調節細胞基因的表達已受到人們的高度 重視，并被廣泛應用于科研及臨床研究中。近年來大量實驗和臨床研究均證實，針刺心包經內關穴對缺血心肌具有明顯的保護作用，而降低缺血再灌注損傷程度，有 效保護心肌也一直是國內外醫學界十分關注的課題。本項研究通過觀察電針內關對心肌缺血再灌注損傷大鼠NO、NOS及凋亡調控基因baX的影響，試圖闡明電 針內關抑制心肌缺血再灌注損傷的作用機制。
1 材料與方法
1.1動物與分組
Wistar大鼠50只，體重250-300g，雄性，由湖南中醫藥大學動物中心提供。將50只動物隨機分為5組：假手術組、缺血再灌注模型組、針刺內關治療組、針刺列缺對照組、針刺合谷對照組，每組10只動物。
1.2實驗方法
10% 烏拉坦（1ml/100g）腹腔注射麻醉，行插管，接動物人工呼吸機，于第三、四肋間隙處開胸，暴露心臟，冠心動脈左前降支根部穿零號醫用縫合線，心電圖 監測，穿線處置一硅膠管結扎左前降支，以左室前壁發紺并向外膨脹及心電圖及S-T段抬高為標志，關閉胸腔，40min后開胸，剪開硅膠管，恢復左前降支灌 流，60min后，取靜脈血，摘取心臟。
假手術組：冠狀動脈左前降支根部穿線后，心電圖監測，記錄120min內心電圖S-T段變化，取靜脈 血，摘取心臟。缺血再灌注模型組：左冠狀動脈前降支根部穿線后，心電圖監測，結扎左前降支40min，再灌注60min后，取靜脈血，摘取心臟。電針內關 治療組、電針列缺對照組、電針合谷對照組：冠狀動脈左前降支根部穿線后，心電圖監測，關閉心電圖機，電針穴位20min，去電針，心電圖監測，結扎左前降 支40min，電針穴位20min，再灌注60min后，取靜脈血，摘取心臟。
1.3針刺方法
“內關”和“合谷”穴定位參照《中國針 灸匯萃•獸醫針灸卷》標準穴位圖譜；“列缺”穴定位采取擬人比照法，電針用G6805電針儀，疏密波刺激（疏波30Hz，密波100Hz），強度 6-15V，進針深度0.5cm左右，針刺“內關”、“合谷”、“列缺”組均將負極接兩側穴位，正極接鼠尾，以前肢出現輕微顫動為度。
1.4觀察指標與檢測方法
1.4.1 心肌一氧化氮（NO）檢測 摘取心臟，置于冰冷的生理鹽水中沖洗，除去血液，濾紙拭干，分析天平稱取0.2g心肌組織，放入小燒杯內，用刻度吸管加入組 織塊重量9倍的生理鹽水，眼科小剪剪碎組織塊，倒入玻璃勻漿管中，置于勻漿機上，搗桿垂直插入管中，上下轉動研磨40-50次，制備成10%的組織勻漿 液，倒入離心管中，350rpm常溫離心15min，取10%心肌組織勻漿上清液0.5ml，按一氧化氮試劑盒檢測步驟，用754紫外分光光度計測定。
1.4.2 心 肌一氧化氮合酶（NOS）活性檢測 取組織勻漿上清液100ul，加入底物緩沖液200ul，促進劑10ul，顯色劑100ul，37℃水浴準確反應 15min，加入透明劑100ul，終止液2000ul，混勻。754紫外分光光度計，蒸餾水調零，530nm處，1cm光徑比色測吸度A值，以雙縮脲法 測定其組織蛋白含量。
1.4.3 baX蛋白含量測定 采用免疫組化測定，動物再灌注60min后，摘取心臟，取結扎下方左心室肌，大小 1cm×0.8cm×0.3cm，10%中性福爾馬林固定，經處理制成蠟切片，PBS沖洗，加過氧化酶阻斷溶液，室溫孵育，PBS沖洗，抗原修復，加第 一、第二抗體，鏡下觀察，蘇木素復染，常規分化（脫水、透明、中性樹膠封片，試劑盒均由福建邁新生物技術開發公司提供）。
1.5統計方法
各組數據均以“x-±s”表示，采用統計軟件SPSSll.10進行數據處理，其差異顯著性檢驗采用方差分析，組間比較若方差齊時選用CSD法；方差不齊時用DunnetT3法。
2 結果
2.1各組NO及NOS的影響結果
模 型組心肌NO含量與假手術組相比，有降低趨勢，但差異無顯著性意義(P＞0.05),可能與手術外傷的應激性及樣本數偏少有關。電針內關組與模型組相比， 電針內關組心肌NO含量顯著高于模型對照組(P＜0.05)，且電針內關組與列缺組相比，心肌NO含量也高于列缺組。而電針列缺組和電針合谷組心肌NO含 量雖有升高，但與模型組相比差異無顯著性意義(P＞0.05)。以上結果提示，電針內關可使心肌缺血再灌注后心肌局部NO含量升高。
與此同時， 由表1可見,模型組心肌總NOS活性顯著低于假手術組（P＜0.05)，電針內關組心肌總NOS活性顯著高于模型組（P＜0.01)，及電針列缺組和電針 合谷組（P＜0.01)。電針列缺組和電針合谷組心肌總NOS活性與模型組比較雖有升高，但差異無顯著性意義（P＞0.05)，表明電針內關可使心肌局部 NOS活性升高。
表1 電針內關穴對心肌細胞NO及NOS變化的比較（x-±s)
組別 例數 NO(Umol/gprot) NOS(u/mgprot)
假手術組 10 311.25±70.4 37.8＜5.28
模型組 10 270.21±72.26 30.98＜3.77
內關組 10 379.54±56.02** 42.98＜3.42**
列缺組 10 306.21±61.65 33.07＜7.79
合谷組 10 322.93±75.74 33.79＜8.19
F值 3.198 5.518
P值 ＜0.05 ＜0.01
注：與模型組比較*P＜0.05，*** P＜0.01；
與列缺組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；
與合谷組比較# P＜0.05。
2.2各組baX蛋白表達比較
心 肌細胞中baX蛋白的表達位于胞質內，呈棕黃色。缺血再灌注模型組陽性率增高，與假手術組比較有顯著差異(P＜0.01)；內關組陽性率明顯減少，與模型 組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)；列缺組、合谷組陽性率與模型組比較無顯著性差異(P＞0.05),見表2。
表2 各組大鼠baX蛋白表達灰光度的比較（x-±s）
組別 例數 baX
假手術組 8 129.72±43.90**
模型組 8 81.64±33.27ΔΔ
內關組 8 115.51±32.45**
列缺組 7 85.05±39.30ΔΔ
合谷組 8 88.05±43.67ΔΔ
注:與假手術組比較ΔΔP＜0.01；與模型組比較**P＜0.01。
3 討論
內關穴為心包經絡穴，又為八脈交會穴，通于陰維脈，《難經·二十九難》曰：“陰維為病苦心痛。”內關的穴位特性決定了它主治的病征。該穴為人身五大重要穴之一，長期以來一直是治療心胸疾病的首選穴位。
有實驗發現，內源性NO可保護心肌缺血再灌注時心肌損傷，而給予NO的抑制劑則可擴大心肌梗死面積[5]。NO還是內皮細胞分泌的血管舒張因子的重要組成成分，具有舒張血管、降低血壓、抑制平滑肌增殖和血細胞粘附、浸潤等重要生理作用。
bcl- 2和baX是bcl-2大家族中的兩個重要成員，研究證實兩者對凋亡細胞起著截然不同的調節作用。Misao等[6]對急慢性心肌梗死患者心肌組織進行免 疫組化檢測發現，bcl-2在急性梗死周圍的非梗死區表達增加，而對照組和陳舊性梗死心肌細胞無bcl-2表達，但baX則主要在陳舊性梗死附近心肌表 達，認為bcl-2的表達和baX的過度表達在缺血再灌注后心肌細胞凋亡的保護和促進中起著重要的病理生理作用。
通過免疫組化染色顯示，電針內 關穴對由于缺血再灌注損傷引起細胞凋亡的調控基因baX蛋白基因有抑制作用[7]。電針內關穴對由于缺血再灌注損傷引起細胞凋亡的調控基因bcl-2有促 進作用。通過baX在各組大鼠心肌組織中的表達陽性率的比較，充分說明電針內關穴對心肌細胞的保護作用。
參 考 文 獻
[1]Dimerman TL，Lowenstein CJ. Snvder SH Molecular mechanisms of nitric oxidc regulation[J]. Cir Res 1993，73:217-222.
[2]林麗娜，王萬鐵，李東.一氧化氮合酶在家兔心肌缺血再灌注損傷中的作用[J].浙江醫學，1999，21(11):655.
[3]崔世濤，朱洪生.心肌缺血再灌注損傷中一氧化氮合酶及其基因異常表達的研究[J].中華醫學雜志，1998，18(5):327.
[4]朱國萍，婁陽，徐沖.bcl-2蛋白家族與細胞凋亡[J].細胞生物學雜志,2001,23(1):20-23.
[5]Williams MW, TaftCS, Ramnauth S, et al. Endogenous nitic oxide(NO) protects against: schaemia- reperfusion injury in the rabbit. Cardiovasc Res，1995，30(1):79-86.
[6]Misao J, Hayakana Y, Ohno M, et al. Expression of bcl-2 protein, an inhibitor of apoptosis, and bax, an accelerator of apoptosis, in ventricular myocytes of human hearis with myocard:al infarction[J]. Circulation, 1996,94(7):1 506-1512.
[7]林亞平，嚴潔，王超，等.電針內關對心肌缺血再灌注損傷大鼠cTnT及baX基因表達的影響.湖南中醫學院學報，2006,26(2)：40-42
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