siRNA沉默Annexin��1 基因?qū)Π螂装㏕24細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

【摘要】  目的 觀察RNA 干擾技術(shù)沉默Annexin��1基因表達(dá)對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖能力的影響。方法 針對(duì)Annexin��1基因不同部位設(shè)計(jì)并化學(xué)合成3對(duì)不同的靶向小干擾RNA(siRNA),脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后應(yīng)用半定量RT�睵CR和Western印跡法檢測(cè)Annexin��1 mRNA和蛋白的改變，透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，用MTT法檢測(cè)沉默Annexin��1表達(dá)對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 轉(zhuǎn)染siRNA后膀胱癌T24細(xì)胞Annexin��1 mRNA和蛋白水平顯著下降(P<0.05)，轉(zhuǎn)染siRNA沉默Annexin��1基因表達(dá)后膀胱癌T24細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡細(xì)胞，增殖能力顯著下降(P<0.05)。結(jié)論 RNA 干擾Annexin��1基因后其mRNA 和蛋白水平顯著下降，誘導(dǎo)了膀胱癌T24細(xì)胞凋亡，并且抑制細(xì)胞的增殖。

【關(guān)鍵詞】  膀胱癌;Annexin��1;siRNA

　　【Abstract】 Objective To explore the effects of Annexin��1 gene silencing by small interfering RNA(siRNA) on bladder cancer cells T24 in vitro. Methods Three siRNA targeting three different domains of Annexin��1 gene were designed, synthesized, and transfected into bladder cancer T24 cells by lipofectamineTM2000. After transfection, expression of Annexin��1 was detected by RT�睵CR and Western blotting. Transmission electronic microscope(TEM) was applied to observe the apoptosis cellular morphology. The cellular proliferation inhibitory ratio was eva luated by MTT assay. Results Compared with the negative control (siRNA�睳C) groups, transfection of three targeting siRNA in T24 cells decreased the expression of Annexin��1 mRNA and protein. Annexin��1 gene silencing reduced the proliferative capacity of T24 cells and leaded to tumor cells apoptosis after transfection. Conclusions The chemically synthesized specific siRNA targeting Annexin��1 could effectively reduce the expression of Annexin��1 gene, reduce the proliferative capacity of T24 cells and induce tumor cells apoptosis.

　　【Key words】 Bladder cancer; Annexin��1; siRNA

　 膜聯(lián)蛋白��1(Annexin��1)增強(qiáng)感染局部的凋亡表明它對(duì)腫瘤的診斷和治療有重要意義，因此該蛋白質(zhì)與腫瘤細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)相關(guān)〔1，2〕。目前，Annexin��1的表達(dá)缺失是否與膀胱癌細(xì)胞的異常增殖潛力相關(guān)以及對(duì)化療藥物的敏感性尚未明了，本研究利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)通過沉默Annexin��1基因直接觀察Annexin��1表達(dá)缺失對(duì)膀胱癌細(xì)胞體外增殖能力的影響，為進(jìn)一步揭示該基因促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制提供理論依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料 膀胱癌T24細(xì)胞株(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)，RNA干擾試劑盒(SilencerTM siRNA Construction Kit)購自美國(guó)Ambion公司。陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000、Trizol、M�睲LV購自Invitrogen 生命技術(shù)公司。RPMI1640、IMDM、胰蛋白酶購自GIBCO公司。

　　1.2 小干擾RNA(siRNA)的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 中Annexin��1基因序列(GenBank Accession No.NM000700)和siRNA設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Ambion生物公司的設(shè)計(jì)軟件(siRNA Target Finder and Design Tools)，自Annexin��1 mRNA的起始密碼子開始，尋找“AA”二連序列，記下其3′端的19個(gè)堿基序列作為候選的siRNA靶序列。將候選序列在GenBank中用Blast軟件進(jìn)行同源序列搜索，排除那些和其他基因編碼序列或EST同源的候選序列。最終選擇了3段21個(gè)堿基的siRNA序列(TI、TⅡ、TⅢ)，分別靶向Annexin��1基因的240��260 (SI) ，435��455 (SⅡ)和 506��526 (SⅢ)區(qū)域(見表1)。另外，根據(jù)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，設(shè)計(jì)與TI(240siRNA)序列含有同樣核苷酸比例的隨機(jī)對(duì)照siRNA(240c1，240c2)做為陰性對(duì)照，用Blast驗(yàn)證隨機(jī)序列與GenBank中其他已知人類基因序列沒有同源性。利用針對(duì)三磷酸甘油醛脫氫酶(β�瞐ctin)基因的正、反義寡核苷酸模板作為RNA干擾實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照。設(shè)計(jì)的正反義寡核苷酸模板3′端均加上T7啟動(dòng)子引物5′CCTGTCTC3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

　　1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 設(shè)計(jì)1對(duì)Annexin��1的引物，上游：5′�睪ACCACCTCAACTCAAGGAC��3′,下游：5′�睞GGAAGCTGGATGAAGAGAC��3′，長(zhǎng)度 546 bp，同時(shí)設(shè)計(jì)1對(duì)管家基因β�瞐ctin引物，上游：5′�睞CCACAGCTGAGAGGGAAATCG��3′，下游：5′�睞GAGGTCCTTACGGATGTCAACG��3′，長(zhǎng)度290 bp，由上海生工合成。

　　1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)染前夜，細(xì)胞培養(yǎng)液更換為用無血清和無抗生素的IMDM，置于37℃、 5% CO2孵箱,轉(zhuǎn)染后用20%FBS IMDM培養(yǎng)液,按常規(guī)方法培養(yǎng),取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用Opti�睲EMⅠ轉(zhuǎn)染液及脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑，按試劑盒說明優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，分別將3對(duì)siRNA和陽性對(duì)照篩選出的干擾序列的scramble siRNA(siRNA�瞡eg)以400 nmol/L的終濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)液，孵育24、48、72 h后收獲細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。表1 靶向Annexin��1的siRNA核苷酸序列

　　1.5 半定量RT�睵CR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后膀胱癌T24 細(xì)胞Annexin��1 mRNA 的表達(dá)水平 Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，用2 μg總RNA進(jìn)行cDNA的合成，半定量RT�睵CR方法檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)24、48、72 h細(xì)胞中Annexin��1 mRNA表達(dá)水平，β�瞐ctin作內(nèi)對(duì)照。PCR 擴(kuò)增條件An