實時熒光定量PCR檢測人IL��9 mRNA方法的建立及應用

【摘要】  目的： 建立檢測人白介素��9 (interleukin��9，IL��9) mRNA的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR( real�瞭ime fluorescence quantitative PCR, qRT�睵CR)方法。方法： 分離人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，經(jīng)PMA和離子霉素刺激活化后提取總RNA并逆轉錄成cDNA。擴增產(chǎn)物與pMD��18T載體連接構建質粒標準品。采用qRT�睵CR方法檢測IL��9 mRNA的表達水平。評價該方法的線性及特異性，應用該方法檢測Graves病患者PBMC中IL��9 mRNA 表達水平。結果： 建立了人IL��9的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法。該法的標準曲線相關系數(shù)r2為0.995～0.998，熔解曲線分析產(chǎn)物為單峰。Graves病患者PBMC中IL��9 mRNA的相對表達水平明顯高于健康對照組(P<0.01)。結論： 建立的檢測人IL��9 mRNA的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法靈敏、特異性好，為進一步臨床應用提供了實驗基礎。

【關鍵詞】  白細胞介素��9; 實時熒光定量PCR; SYBR GreenⅠ

　　[Abstract] Objective: To establish a SYBR GreenⅠ based real�瞭ime fluorescence quantitative PCR (qRT�睵CR) method for detection human interleukin��9 (IL��9) mRNA expression. Method: The specific primers were designed according to the conserved sequence of human IL��9 gene. Total RNAs were extracted from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which were stimulated by PMA and ionomycin, then the RNAs were transcribed reversely into cDNAs. The plasmid standards were constructed. The sensitivity and specificity of the method were eva luated. The relative expression levels of human IL��9 mRNA in PBMCs from patients with Graves′ disease (GD) and healthy controls were detected by this method. Results: The coefficient of correlation of the standard curve of this method was 0.995-0.998, melting curve analysis showed single peak. The relative expression levels of human IL��9 mRNA in GD group were higher than that in healthy control group (P<0.01). Conclusion: The method to detect IL��9 by SYBR GreenⅠbased qRT�睵CR was good in sensitivity, specificity and linear function. It can be used as a standard method of qRT�睵CR for detection of human IL��9 expression.

　　[Key words] interleukin��9; real�瞭ime fluorescence quantitative PCR; SYBR GreenⅠ

　　早先認為IL��9是由Th2細胞分泌的一種細胞因子，在抗寄生蟲感染及過敏性哮喘中發(fā)揮重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)有一種新的CD4+T細胞亞群，主要分泌IL��9及IL��10，稱之為“Th9細胞”, 在炎癥反應及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的作用[1-3]。我們建立了一種檢測人IL��9 表達的實時熒光定量PCR(real�瞭ime fluorescence quantitative PCR, qRT�睵CR)方法，并應用于Graves病患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中人IL��9 mRNA的檢測，為進一步研究IL��9在臨床中的應用提供了實驗手段。歷史論文發(fā)表

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 研究對象 Graves病患者組22例(男5例，女17例)，平均年齡(31.4±9.4)歲，均為經(jīng)江蘇大學附屬人民醫(yī)院確診的初診患者。健康對照組20例(男5例，女15例)，平均年齡(29.6±10.3)歲，無慢性疾病及自身免疫性疾病。

　　1.1.2 主要試劑和儀器 人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物技術有限公司)，RPMI��1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)、離子霉素(Sigma公司)，Trizol(Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒FSK��101(ToYoBo公司)，rTaq酶、dNTPs、10×PCR 緩沖液、pMD18�睺載體、BamH Ⅰ 、Hind Ⅲ(TaKaRa公司)，熒光定量PCR試劑盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMix�睻DG with ROX(Invitrogen公司)，Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀(Stratagen公司)，pMD18T�拨陋布�動蛋白質粒由本實驗室構建并保存。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 引物設計及合成 利用Oligo 6.0軟件根據(jù)基因庫中IL��9(NM_000590)的序列設計PCR引物。IL��9：上游引物5′�睠CAGCTTCCAAGTGCCACTGC��3′; 下游引物5′�睺GCATGGTGGTATTGGTCATCTG��3′;擴增片段125 bp。β�布�動蛋白：上游引物5′�睠ACGAAACTACCTTCAACTCC��3′;下游引物5′�睠ATACTCCTGCTTGCTGATC��3′;擴增片段262 bp[4]。以上引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

　　1.2.2 樣本處理 取5 ml肝素抗凝靜脈血，使用人淋巴細胞分離液分離PBMC， 用RPMI��1640完全培養(yǎng)基調整細胞密度為1×106/ml，取1 ml放入24孔板，以50 ng/ml PMA和1 μg/ml離子霉素于5%CO2、37℃刺激培養(yǎng)5 h后收集細胞，加入1 ml Trizol試劑裂解細胞，提取總RNA。用逆轉錄試劑盒以Oligo(dT)20將總RNA逆轉成cDNA。反應條件：42℃，20 min;99℃，5 min;4℃，5 min。合成的cDNA存于-20oC冰箱備用。

　　1.2.3 pMD18T�睮L��9重組質粒的構建 以上述制備的cDNA為模板，利用PCR擴增IL��9片段。反應條件：94℃預變性5 min;94℃，30 s;58℃，30 s;72℃，30 s;35個循環(huán);72℃，7 min。將PCR產(chǎn)物與pMD18�睺載體進行T�睞克隆，經(jīng)BamH Ⅰ 酶切、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切及PCR鑒定，陽性克隆送上海英駿公司測序，證實與基因庫中IL��9序列完全一致。陽性克隆菌株通過LB培養(yǎng)基擴增，抽提并純化質粒，將純化質粒稀釋成102～107/μl作為標準品，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2.4 標準曲線的制備 以稀釋的標準品作為模板在熒光定量PCR儀上進行擴增，制備標準曲線。根據(jù)試劑盒說明：50℃ 2 min;95℃ 預變性2 min;95℃ ，15 s; 58℃(IL��9)/56℃ (β�布�動蛋白)，20 s;82℃(IL��9)/86℃(β�布�動蛋白)8 s;擴增40(IL��9)/30(β�布�動蛋白)個循環(huán)。為避免引物二聚體干擾，分別在82℃(IL��9)/86℃(β�布�動蛋白)收集熒光信號。擴增結束后由儀器軟件繪制標準曲線。

　　1.2.5 特異性的評價 標準品及臨床標本cDNA在熒光定量PCR儀上進行擴增后進行熔解曲線分析，檢測PCR產(chǎn)物是否為目的產(chǎn)物，分析該方法的特異性。

　　1.2.6 樣本IL��9 mRNA相對表達量的檢測 將樣本cDNA、標準品、空白對照以上述反應體系及條件同時進行擴增，根據(jù)標準曲線分別檢測每個樣本的IL��9和β�布�動蛋白的拷貝數(shù)，并以β�布�動蛋白為參照校準IL��9的相對表達。

　　1.2.7 統(tǒng)計學分析 利用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以中位數(shù)及四分位數(shù)間距(interquartiles range, IQR)表示，組間比較采用Mann�瞁hitney檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結 果

　　2.1 人IL��9 mRNA SYBR GreenⅠ實時熒光定量方法學的建立

　　2.1.1 pMD18T�睮L��9重組質粒的鑒定 pMD18T�睮L��9重組質粒經(jīng)BamH Ⅰ 和Hind Ⅲ雙酶切，可見2560 bp的載體片段及164 bp小片段，同時經(jīng)PCR擴增出125 bp的片段(圖1)。質粒測序結果顯示其序列與IL��9基因序列完全一致，從而證實pMD18T�睮L��9陽性質粒構建成功。

　　1：TaKaRa DL2000 DNA 標準參照物; 2：pMD18T�睮L��9質粒PCR產(chǎn)物; 3：pMD18T�睮L��9 BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切; 4：pMD18T�睮L��9質粒 BamH Ⅰ酶切; 5：TaKaRa 250 bp 標準參照物

　　圖1 pMD18T�睮L��9重組質粒的鑒定結果

　　Fig 1 Identifying result of recombinant plasmid pMD18T�睮L��9

　　2.1.2 IL��9標準質粒的擴增曲線及標準曲線 將構建成功的pMD18T�睮L��9質粒稀釋10倍為107～102 拷貝數(shù)/μl作為模板進行擴增，制備其標準曲線。其擴增曲線見圖2a，其標準曲線如圖2b所示。相關系數(shù)r2 為0.995～0.998;斜率M為-3.252。其擴增效率為103%。

　　2.1.3 qRT�睵CR檢測IL��9 mRNA方法的特異性 為檢驗該方法的特異性，在每次擴增后均進行熔解曲線分析，由圖3可以看出質粒標準品和臨床標本cDNA的擴增產(chǎn)物為單一峰，表明只有IL��9目的基因的擴增而無其他雜帶，特異性好。

　　2.2 Graves病患者PBMC中IL��9 mRNA相對表達水平的檢測歷史論文發(fā)表

　　Graves病組和健康對照組的IL��9 mRNA相對表達水平以IL��9/β�布�動蛋白比值表示。圖4顯示Graves病組和健康對照組的比值分別為0.0003(IQR 0.00004～0.001)和 0.0018(IQR 0.001～0.004)，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

　　3 討 論

　　機體內CD4+T細胞是包括許多亞群的異質性細胞，在體內微環(huán)境的作用下，能分化成不同類型具有不同免疫功能的亞群，如Th1、Th2、Treg及Th17等 [5]。Th1主要分泌IFN�拨谩�IL��2 、TNF�拨� ，主要介導細胞免疫; Th2主要分泌IL��4和IL��5，介導體液免疫和抗寄生蟲感染;Treg細胞在體內調節(jié)Th細胞和Tc細胞使之處于動態(tài)平衡從而維護機體的免疫自身穩(wěn)定[6]; Th17主要分泌IL��17、IL��22 等因子，在自身免疫性疾病的發(fā)生及抗感染中發(fā)揮重要作用[7]。最近，又鑒定出“Th9”細胞，為已有的Th細胞亞群又增添了新成員。TGF�拨�1及IL��4的聯(lián)合作用可使抗原刺激活化的初始型CD4+ T細胞分化為Th9細胞[1]。Th2細胞在TGF�拨�1的作用下也可轉分化為Th9細胞[2]。原認為是Th2類細胞因子的IL��9，現(xiàn)認為是由Th9細胞分泌，因此檢測IL��9的表達對研究Th9細胞分化及其在自身免疫性疾病、慢性炎癥、腫瘤等疾病中的作用有著重要的臨床和科研意義。

　　Graves病是一種器官特異性自身免疫性疾病，機體產(chǎn)生抗促甲狀腺激素受體及甲狀腺球蛋白等自身抗體[8]，其具體的致病機制還未闡明，傳統(tǒng)上大多數(shù)學者認為Graves病是由體液免疫應答異常所引起的[9]，但Th9細胞在Graves病中的作用未見報道。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Graves病患者外周血中IL��9 mRNA的表達水平明顯高于健康對照組(P<0.01)，這提示患者體內可能存在著Th9細胞的極化及IL��9, IL��10等細胞因子表達增強的現(xiàn)象，為探究Graves病的致病機制及治療手段提供了新的思路。

　　本研究建立了一種檢測人IL��9 mRNA的 qRT�睵CR方法。在pMD18T�睮L��9質粒標準品為102～107/μl范圍內，該方法標準曲線的相關系數(shù)為0.998，說明該方法的線性較好，靈敏度高;斜率為-3.252具有很好的擴增效率(103%)。同時，樣本cDNA擴增后的熔解曲線呈單個峰，只有目的基因而無引物二聚體等非特異性擴增產(chǎn)物，說明該方法的特異性較好。因此，本研究建立的檢測人IL��9 mRNA的qRT�睵CR方法特異、靈敏，能夠準確檢測IL��9 mRNA的含量，從而為進一步的臨床檢測提供了實驗基礎。

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