穹窿切斷并摘除腎上腺后大鼠下丘腦CRH表達變化

【摘要】  　　目的：觀察下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素（corticotropin releasing hormone, CRH）與糖皮質激素的關系，探討海馬參與HPA軸調節的機制。方法：建立大鼠穹窿切斷模型，采用ELISA方法檢測穹窿切斷0、4、7、10d血中糖皮質激素的濃度;建立大鼠穹窿切斷同時摘除腎上腺7d的模型，采用免疫組織化學、免疫印跡方法檢測CRH的表達變化。結果：穹窿切斷7d后血中糖皮質激素的濃度升高，穹窿切斷同時摘除腎上腺7d后，下丘腦CRH表達升高。結論：海馬通過穹窿對HPA 軸發揮負反饋調節作用，糖皮質激素負反饋調節下丘腦CRH。

【關鍵詞】  穹窿切斷術；穹窿切斷并摘除腎上腺； 促腎上腺皮質激素釋放激素；下丘腦

　　［ABSTRACT］ Objective: To observe the relation between corticotropin releasing hormone （CRH） and glucocorticoid and to explore the mechanism of the hippocampus involved in HPA axis regulation. Methods: The fornix was transected to establish a animal model，ELISA was used for detection of glucocorticoid concentrations on day 0，4，7 and 10 after fornix transaction. Immunohistochemical method and Western Blotting were respectively used for the expression of CRH in the hypothalamus after fornix transection and adrenalectomy.  Results: Glucocorticoid concentration was increased on the 7th day after fornix transection. The expression of CRH was up�瞨egulated on the 7th day after fornix transection and adrenalectomyon. Conclusions: The hippocampus provides a negative feedback to the HPA axis through fornix , the glucocorticoid has a negative feedback effect on CRH. 
   
　　［KEY WORDS］ Fornix transection;  Fornix transection and adrenalectomy; Corticotropin releasing hormone;  Hypothalamus

    應激反應是以下丘腦�� 垂體�� 腎上腺 (hypothalamic�瞤ituitary�瞐drenal, HPA)軸的激活為核心的生理和心理反應。應激后促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)在HPA軸中發揮重要作用, 控制著HPA軸的興奮水平［1］。研究表明海馬對HPA軸有負反饋調節作用，可能是因為海馬媒介穹窿對下丘腦室旁核產生了抑制作用。本課題組前期實驗通過建立大鼠穹窿切斷模型，觀察到穹窿切斷7d后，下丘腦室旁核神經元CRH的表達升高，10d升高顯著［2，3］。此結果提示我們，穹窿切斷后海馬對下丘腦室旁核的抑制作用減弱, 室旁核合成CRH增多, HPA軸活動增強。但是血中糖皮質激素的濃度升高是否是HPA軸活動增強的結果，這一點還未曾證實。本實驗建立大鼠穹窿切斷模型，檢測糖皮質激素濃度變化情況，以進一步驗證海馬是否媒介穹窿對下丘腦室旁核產生了抑制作用。此外通過實施穹窿切斷術同時摘除其腎上腺，觀察CRH的表達變化，研究糖皮質激素與CRH的關系，為研究揭示應激的變化機理提供一定的理論和實驗依據。

　　1  材料和方法

　　1.1  動物及分組教育核心期刊論文發表 
   
　　成年健康雄性Wistar大鼠90只， 200～220g，購于中國醫科大學實驗動物中心，實驗室條件飼養，隨機分為12組，即穹窿切斷0、4、7、10d組、相應假手術組和相應正常組，每組5只，共60只，用于ELISA檢測。剩余大鼠隨機分為穹窿切斷并摘除腎上腺7d組、相應假手術組和相應正常組。每組10只，共30只，用于免疫組織化學和免疫印跡法各半。

　　1.2  實驗方法

　　1.2.1  穹窿切斷動物模型

　　將大鼠用戊巴比妥麻醉后，固定于江灣IC型腦立體定位儀，常規消毒、剪毛，正中切開頭皮，暴露出顱骨，于前囟后1.5mm，中線外左右1.0mm處，用電動開顱器鑿開顱骨，切開硬腦膜，自制的雙刃刀置于上述部位的腦表面（相當于穹窿部位），續降刀6mm，切斷穹窿，降刀時間約1min，假手術組降刀2mm（未切穹窿），刀在腦中均停留5min。清潔顱面，縫合頭皮，常規飼養，抗生素控制感染［4］。

　　1.2.2  穹窿切斷并摘除腎上腺模型

　　建立穹窿切斷動物模型后，將大鼠俯臥位固定于蛙板上。從最后胸椎處向后沿背部正中線做約2cm長的皮膚切口。在腎前內側脊柱下方找到淡黃色的腎上腺并摘除, 同法摘除右側腎上腺(位置稍靠前) , 縫合肌肉和皮膚, 并涂以碘酊。假手術組進行與實驗組相似的手術，但不摘除腎上腺。術后保持室溫為21～25℃, 以葡萄糖、生理鹽水代替飲水［5］。

　　1.3  ELISA 檢測血清糖皮質激素水平
   
　　取穹窿切斷大鼠眼窩靜脈叢血液，每次采血0.5mL，消毒棉球壓迫眼球止血30s。采血后離心取血清，相應反應板孔中加入20μL標準品，20μL血清標本，每板孔再加入200μL酶聯物，室溫 60min。洗滌液洗滌反應板，每孔加入100μL顯色液，室溫溫育15min。每孔加入100μL終止液。輕輕混勻30s；60min內450nm處讀OD值，再換算成質量濃度。

　　1.4  免疫組織化學SABC法顯色
   
　　穹窿切斷并摘除腎上腺大鼠施心灌流、固定，用恒冷箱切片機（型號Leica）制作冷凍切片，厚14μm，3%H2O2�布状�20min、0.03% Triton X��100浸泡10min，5％BSA 封閉20min后，滴加CRH抗體（工作濃度為1:500），陰性對照組加0.01mol/L PBS代替一抗，4℃孵育過夜, 滴加二抗IgG 37℃、20min，滴加SABC 37℃、20min，DAB顯色, 脫水, 透明, 中性樹膠封片, 光學顯微鏡（OLYMPUS, BX60, Japan）下觀察，攝片。

　　1.5  免疫印跡法國家級教育論文發表 　　取穹窿切斷并摘除腎上腺大鼠新鮮下丘腦組織經勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心，11000 r/min，取上清；每例標本提取蛋白50μg，7.5％SDS�睵AGE變性凝膠電泳，濃縮膠80V，30min，分離膠120V，90