Apoptin原核表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)

【摘要】  　　目的 構(gòu)建Apoptin的原核表達(dá)載體，并制備抗原物質(zhì)Apoptin融合蛋白。方法 在獲得Apoptin融合基因的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了Apoptin的高效原核表達(dá)載體pET-28a(+)-Apoptin，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)受體菌中，以IPTG對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析目的蛋白。結(jié)果 轉(zhuǎn)化有Apoptin的原核表達(dá)載體pET-28a(+)-Apoptin的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE分析，在相對(duì)分子質(zhì)量約17 000的位置出現(xiàn)目的蛋白條帶，大小與Apoptin融合蛋白一致。結(jié)論 Apoptin原核表達(dá)載體pET-28a(+)-Apoptin能夠表達(dá)出Apoptin融合蛋白，為進(jìn)一步的Apoptin研究和制備Apoptin抗體奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】  Apoptin 原核表達(dá)載體 pET-28a(+) 大腸桿菌

　　ABSTRACT: Objective  To construct an Apoptin prokaryotic vector, aiming to produce antigenic fusion protein Apoptin. Methods  The Apoptin gene was amplified from the template of plasmid pSSCHG/NT4-Apoptin- HA2-TAT by PCR. The Apoptin was sub-cloned into the multiple clone sites of plasmid pET-28a (+) to get the prokaryotic vector of pET-28a (+)-Apoptin, which was transformed into E.coli BL21 (DE3). Expression of E.coli BL21 (DE3) was induced by IPTG. The specific protein expression was detected by SDS-PAGE. Results  The fusion protein was expressed with high efficiency in E.coli BL21 (DE3) transformed by pET-28a (+)-Apoptin after induction with IPTG. The specific fusion protein had an apparent related molecular weight of about 17 000 ku as indicated by SDA-PAGE analysis. Conclusion  The Apoptin prokaryotic expression vector with pET-28a (+)-Apoptin can effectively express Apoptin fusion protein, laying a foundation for further study of Apoptin and preparation of antibodies against Apoptin.

　　KEY WORDS: Apoptin; prokaryotic expression vector; pET-28a (+); E.coli

　　目的基因或載體對(duì)正常組織的毒性和腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的耐受等是限制腫瘤基因治療臨床應(yīng)用的瓶頸。Apoptin(凋亡素)的發(fā)現(xiàn)突破了上述瓶頸，給抗腫瘤的基因治療帶來(lái)了轉(zhuǎn)機(jī)。Apoptin是雞貧血病毒(chicken anemia virus, CAV)的vp3基因編碼的蛋白質(zhì)，體外合成或基因工程表達(dá)的Apoptin能特異的引起多種人源性惡性腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)正常二倍體體細(xì)胞無(wú)作用；且這種選擇性凋亡作用既不依賴于p53的介導(dǎo)，也不被bcl-2過(guò)表達(dá)所抑制［1］，顯示其可能在腫瘤基因治療中具有迷人的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)在獲得CAV Apoptin基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建Apoptin的原核表達(dá)載體(圖1)，為下一步表達(dá)特異性蛋白產(chǎn)物、制備Apoptin抗體奠定基礎(chǔ)［2］。

　　1  材料與方法護(hù)理論文發(fā)表

　　1.1  質(zhì)粒、菌株、工具酶及試劑
 
　　含Apoptin全基因組序列的體外克隆NT4-Apoptin-HA2-TAT重組腺相關(guān)病毒由本課題組構(gòu)建［2］；大腸桿菌Top10、大腸桿菌BL21均來(lái)自西安華廣生物工程公司；質(zhì)粒pGEM-T Easy購(gòu)自Promega公司；質(zhì)粒pET-28a(+)購(gòu)自Novegen公司；限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶購(gòu)自華美生物公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)自MBI公司；主要試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

　　1.2  引物的設(shè)計(jì)和合成

　　根據(jù)前期研究的Apoptin基因序列的結(jié)果［2］，按照載體上正確的插入方向和譯讀框架設(shè)計(jì)一對(duì)引物。引物的5′端分別添加了限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切序列。擴(kuò)增的片段包括Apoptin完整的基因序列。上游引物：5′-GGAATTCATGAACGCTCTCCAAGAAG-3′；下游引物：5′-GCTCGAGTCACAGTCTTATACGCCTTCTTG-3′(下劃線處分別為EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切序列)，由上海生工生物工程公司負(fù)責(zé)合成，用PAGE純化。

　　1.3  目的基因的擴(kuò)增和純化

　　以含有Apoptin全基因組序列的pSSCHG/NT4-Apoptin-HA2-TAT為模板，上下游引物各50 pmol，10×PCR反應(yīng)緩沖液10 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，加超凈水至終體積為49 μL。94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性1 min、50 ℃退火1 min后，再加入1 μL Taq DNA聚合酶。進(jìn)行94 ℃變性1 min、50 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min 30個(gè)循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸5 min。經(jīng)酚/氯仿抽提，無(wú)水乙醇沉淀，70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌沉淀后用30 μL TE充分溶解沉淀。取少量PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外線測(cè)定A260值對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量。

　　1.4  重組質(zhì)粒pGEM-T Easy/Apoptin(pT/Apoptin)的構(gòu)建與鑒定 教育教學(xué)論文發(fā)表

　　取上述PCR產(chǎn)物600 ng(0.2 g/L)、質(zhì)粒pGEM-T Easy 25 ng(50 g/L)、T4DNA連接酶5 u(5 u/μL)、10×T4 DNA連接酶緩沖液2.5 μL以及去離子水18 μL(總體積25 μL)建立連接反應(yīng)體系，23 ℃水浴1h。取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μL感受態(tài)大腸桿菌Top10，涂布LB(Amp+)平皿，37 ℃倒置過(guò)夜。從LB平皿中挑選單菌落用堿裂解法，經(jīng)EcoRⅠ酶切后瓊脂糖凝膠電泳，篩選出正確重組質(zhì)粒進(jìn)行大量制備。對(duì)含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序(上海生工生物工程公司)。

　　1.5  重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Apoptin的構(gòu)建和鑒定

　　將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEM-T Easy/Apoptin、pET-28a(+)分別進(jìn)行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，各取1 μL酶切產(chǎn)物、1 μLT4DNA連接酶、10×T4DNA連接酶緩沖液2.5 μL、去離子水18.5 μL(總體積25 μL)，16 ℃水浴過(guò)夜。取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μL感受態(tài)大腸桿菌