TNFα、Leptin-Rb、NF-κB和PPAR-γ在酒精性肝病大鼠肝細胞中的表達

【摘要】  　　目的 探討TNFα、NF-κB、Leptin-Rb和PPAR-γ等在大鼠酒精性肝病中與肝組織炎癥、壞死和纖維化的關系。方法 胃造瘺法建立長期大鼠酒精性肝病模型，分別在第4、8、12、24和52周用免疫組化、原位雜交和RT-PCR技術檢測不同階段大鼠肝組織中TNFα、NF-κB、PPAR-γ和Leptin-Rb等的表達。結果 TNFα、NF-κB和Leptin-Rb水平在模型組大鼠肝細胞中，第8周表達逐漸增強，第24周起高水平表達一直持續至52周(P<0.01)。PPAR-γ在對照組和第4、8周模型組肝細胞中表達最強，第12周表達開始減弱。TNFα和NF-κB在肝細胞中的表達呈明顯正相關關系，與PPAR-γ則呈負相關關系(P<0.01)。結論 TNFα和NF-κB與肝細胞病變程度有很好的一致性關系,Leptin-Rb在肝細胞的表達與肝纖維化發展相一致，PPAR-γ則剛好相反。

【關鍵詞】  酒精性肝病 細胞因子 大鼠

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the expressions of TNFα, NF-κB, leptin-Rb and PPAR-γ mRNA in liver tissues of rats with alcoholic fatty liver to identify the relationship between these factors and liver inflammation, necrosis and fibrosis. Methods  Long-time rat model groups (gastric cannulation ethanol infusion models of ALD) were made. At the end of 4th, 8th, 12th, 24th and 52th week, the expressions of TNFα, NF-κB and PPAR-γ protein and mRNA in rat liver tissues were observed with immunohistochemical method and in situ hybridization. Reverse transcription polymerase chain reaction was performed to determine the expression of Leptin-Rb mRNA. Results  The expressions of TNFα, NF-κB and leptin-Rb in rat alcoholic fatty liver enhanced gradually from week 8. Strong positive expression lasted from week 24 to week 52. The expression of PPAR-γ was strongly positive in control group and in 4th and 8th week model groups (P<0.01). The expression weakened from week 12. The expression of TNFα in liver tissues was positively correlated with that of NF-κB significantly and negatively correlated with that of PPAR-γ. Conclusion  TNFα and NF-κB were strongly positively correlated with the liver inflammation and necrosis. The expression of leptin-Rb increased in hepatocytes, which induced hepatic fibrosis in rats. The expression of PPAR-γ increased in the initial period and lowered in the later time.

　　KEY WORDS: alcoholic fatty liver; cytokine; rats

　　腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNFα)是一種早期反應的細胞因子，在損傷初期即開始誘導其他促炎及抗炎遞質的表達增加或減少，使體內炎癥反應失衡。核轉錄因子(nuclear factor κappa B, NF-κB)是TNFα炎癥級聯反應中的重要啟動因子，在肝脂肪變和纖維化的發生發展中起著重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ, PPAR-γ)參與多種炎性介質合成及分泌的調節，特別是在脂肪細胞分化、糖脂代謝調節和胰島素抵抗中起重要作用。瘦素(leptin)參與肝臟糖及脂肪的代謝調節，使甘油三酯合成增加，肝糖原產生減少［1］。但是，目前對它們在酒精性肝病發病過程中的作用還不明確，有待做大量的研究工作才能得到驗證。國內在這方面的研究還很少。本實驗擬對TNFα、NF-κB、Leptin-Rb和PPAR-γ等在大鼠酒精性肝病不同階段肝組織中的表達進行檢測，研究它們之間的相互關系及其在肝組織脂肪變、炎癥壞死和肝纖維化的發生、發展過程中的作用。

　　1  材料與方法

　　1.1  實驗儀器與試劑 職稱論文發表期刊

　　梯度PCR儀 9700(美國Gene Amp公司)，自動凝膠掃描成像分析系統(美國 Wealtec公司)，紫外可見分光光度儀(美國Amersham Biosciences公司)；大鼠TNFα mRNA原位雜交試劑盒，大鼠NF-κB P65 mRNA原位雜交試劑盒，兔抗大鼠PPAR-γ多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，RT-PCR一步法試劑盒(TaKaRa 寶生物工程有限公司)，總RNA提取試劑盒(清華天為時代生物工程有限公司)，PCR引物(上海生工生物技術有限公司)。鱟試劑偶氮顯色法測定內毒素(上海市臨床檢驗中心試劑盒)。

　　1.2  實驗方法

　　普通清潔級健康雄性成年SD大鼠80只，體重150-200 g，由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供。飼養于西安兵器工業521醫院衛生研究所實驗動物中心。動物房通風良好，溫度保持在20-27 ℃。經胃造瘺管灌酒制作酒精肝實驗動物模型，并設實驗對照組，具體方法同文獻報道［2］。造模成功后分別于第4、8、12、24周及52周，在各實驗組和對照組中隨機取8只大鼠，硫噴妥鈉30 mg/kg體重腹腔注射麻醉，心包腔無菌穿刺采血處死，常規分離血清，測肝功、甘油三酯(triglyceride, TG)和總膽固醇(total cholesterol, TCh)及血糖(blood glucose, GLU)。另取1 mL血置于肝素化去致熱原試管中，分離血清送第四軍醫大學臨床檢驗中心測定內毒素含量。取肝組織制成石蠟切片常規HE染色，肝組織病理學觀察。同時用免疫組化和原位雜交試劑盒分別檢測肝組織中PPAR-γ，TNFα mRNA和NF-κB P65 mRNA，方法按試劑盒使用說明書稍加改進。肝組織中Leptin-Rb的檢測用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)一步法，常規抽提肝組織RNA后，按試劑盒使用說明書配制RT-PCR反應液總量50 μL，按以下條件