摻鍶磷酸鈣骨水泥的體外細胞生物學性能評價及其與摻鍶量的相關性

【摘要】  　　目的 評價“SrHPO4/Ca4(PO4)2O/CaHPO4”系摻鍶磷灰石骨水泥的生物相容性及其與摻鍶量的關系。方法 通過急性全身毒性、熱原性、溶血性、體外細胞毒性以及成骨細胞在材料表面的黏附、增殖與表達等實驗，檢測材料的性能及生物降解潛能。結果 “SrHPO4/Ca4(PO4)2O/CaHPO4”系摻鍶磷灰石骨水泥的急性全身毒性、熱原性、溶血性、體外細胞毒性均為合格。Sr-CPC的熱原性、溶血性以及堿性磷酸酶值與摻鍶量呈非線性關系。結論 含鍶磷酸鈣骨水泥體外細胞生物相容性良好，是安全的新型骨組織工程支架材料。

【關鍵詞】  摻鍶磷灰石骨水泥 生物相容性 成骨細胞 成纖維細胞

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the biocompatibility of Sr-containing calcium phosphate cement series ［SrHPO4/Ca4(PO4)2O/CaHPO4］. Methods  A series tests, including acute systemic toxicity test, pyrogen test, hemolysis test, cytotoxicity test and in vitro biological behavior of osteoblasts, were designed to eva luate the cytobiology of the material. Results  Sr-containing calcium phosphate cement had excellent biocompatibility and all of the biological eva luation tests were up to the standard. Pyrogen test, hemolysis test and ALP value of Sr-containing calcium phosphate cement behavior had non-linear relationships with the Sr-doped content. Conclusion  Sr-containing calcium phosphate cement series are good in biocompatibility and can be widely used in tissue engineering research.

　　KEY WORDS: Sr-containing calcium phosphate cement; biocompatibility; osteoblast; fibroblast

　　羥基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)塊體陶瓷雖然具有良好的生物相容性與生物活性，但降解極其緩慢［1］。While等［1］報道HAP植入體內后年降解率不高于10%。為了改善其降解性，人們做了大量研究工作，認為通過在HAP人工骨結構中建造宏觀孔洞［2-3］，降低鈣/磷元素比率［4］， HAP晶格引入碳酸根等［5-6］方法可以改善這類材料的降解性。然而，這些方法對其抗壓強度不利或者無積極作用。

　　近年來的大量研究表明，鍶取代鈣摻入磷灰石后對其性能產生重要影響，不僅改善了生物相容性［7］、生物活性［8］、骨傳導性［7］，還協同提高了其降解速率［9-10］與力學性能［11-12］。此外，低劑量Sr還具有促進骨形成、抑制骨吸收［13］、治療骨癌與骨痛等［14］生物學效能。最近，國內西安交通大學［10-11, 15］發明了由磷酸氫鍶(SrHPO4)、磷酸四鈣(Ca4(PO4)2O)、磷酸氫鈣(CaHPO4)組成的摻鍶磷灰石骨水泥(Sr-containing calcium phosphate cement, Sr-CPC)，并對其微觀結構、理化性能等方面進行了系統深入的研究。作為合作研究，本文系統考察了Sr-CPC水化產物的急性全身毒性、熱原性、溶血性、體外細胞毒性以及成骨細胞在材料表面的黏附、增殖與表達等一系列體外細胞生物學性能，并探討了摻鍶量對這些性能的影響規律，為今后材料的進一步改進并應用于醫學領域奠定基礎。

　　1  材料與方法

　　1.1  實驗材料 經濟學論文發表

　　本實驗試樣是Sr-CPC水化產物，為白色粉末(過100目ASTM篩)，由西安交通大學金屬材料強度國家重點實驗室提供，固化前的初始原料與配方見表1，制備方法見文獻［11］。各試樣測試前采用紫外線照射滅菌3 h備用。表1  植入材料的編號與相應成分（略）

　　1.2  急性全身毒性實驗

　　隨機取ICR品系小白鼠12只，體重18-21 g，雌雄各半,均分為實驗組和對照組。將每組材料各3.0 g加入生理鹽水30 mL，37 ℃浸提4 h后，經0.22 μm微孔濾膜過濾，制成100 g/L浸提液。無菌條件下分別向實驗組和對照組的小鼠腹腔內以每克體重0.1mL劑量注射浸提液或生理鹽水，14 d內觀察2組小鼠一般狀況和死亡情況，第14天脫椎處死，解剖觀察2組小鼠各主要臟器的變化。

　　1.3  溶血實驗教育類論文發表

　　實驗用新西蘭白兔1只，體重2.4 kg。心臟穿刺抽取兔血2 mL，立即加入20 g/L的草酸鉀生理鹽水溶液0.1 mL，混合抗凝。取新鮮抗凝兔全血2 mL，加入2.5 mL生理鹽水，稀釋備用。

　　每次分別稱取滅菌備用的Sr-CPC0、Sr-CPC1、Sr-CPC2粉末0.5 g，共5次，各自加入盛有4 mL生理鹽水的15個試管中，編號后作為實驗組；陽性對照組為5個空試管內各加入1 g/L碳酸鈉溶液4 mL。各試管在37 ℃水浴1 h后，分別加入1 mL抗凝兔血，輕搖。37 ℃水浴3 h后，以1 000 r/min速度離心5 min，取上清液，置入比色皿中，用分光光度計在540 nm波長處測其光吸收度，計算材料溶血率。溶血率計算方法：

　　 溶血率=A實驗材料-A陰性對照A陽性對照-A陰性對照

　　1.4  熱原實驗

　　健康成年新西蘭白兔9只，體重1.7-3.1 kg，雌兔無孕，預測體溫進行篩選。

　　采用預試檢查合格的生理鹽水注射液為浸提介質，按材料3.0 g與生理鹽水30 mL的比例制取浸提液。

　　實驗用兔在實驗前1-2 d處于同一環境中，實驗室和飼養室溫差不大于5 ℃，一次實驗全過程室溫變化不大于5 ℃。測定家兔正常體溫時，將家兔裝于固定器內，防止騷動，30 min后開始第1次測溫。將肛門體溫計插入兔肛門，深度約6 cm，每兔的測溫時間至少2 min。符合要求后15 min內，耳緣靜脈緩慢注入材料浸提液，劑量為10 mL/kg，浸提液溫度為38 ℃，注射完畢每隔1 h測溫1次，共測3次，以3次體溫中最高1次減去正常體溫，即為該兔體溫升高度數，根據標準對結果進行評定。

　　1.5  體外細胞毒性評價

　　選用傳代48-72 h生長旺盛的L-929細胞系(小鼠成纖維細胞，第四軍醫大學口腔生物學教研室提供)。DMEM-BFS培養液培養，待細胞長滿培養皿后，2.5 g/L胰蛋白酶消化單層培養細胞，使用培養液中止消化，稀釋，然后將細胞按濃度1×104/mL接種到96孔板中，每孔重復5遍，共接種細胞懸液200 μL。

　　浸提介質為新鮮配制的DMEM-BFS培養液，pH=7.2。將三組試樣粉末分別與浸提介質按1 g/10 mL比例配制