淺談禽用疫苗安全性的檢測方法
作者:顧的樂時間:2015-12-28 13:55:44 來源:www.vortexsignal.com 閱讀次數:1055次 ]
【關鍵詞】: 疫苗 安全 檢測
疫苗(Vaccine) 指的是由病原微生物、寄生蟲以及其組分或代謝產物所制成的,通過疫苗免疫是最有效的防控疫病措施之一。
疫苗是一種特殊藥品,其質量優劣直接關系到畜禽疾病預防的有效性和安全性,也關系到對人類健康和生態環境的影響。因此對疫苗的生產、經營和使用必須有嚴格的監督管理和檢測。我國疫苗的檢測是按照農業部頒布的《獸醫生物制品及檢驗規程》來進行,疫苗的檢測包括安全檢驗、效力檢驗、物理性狀檢驗等相關檢驗。為了保證在養禽生產中使用安全高效的禽用疫苗,各養殖場須在疫苗使用前進行安全性檢測。
目前,禽用活疫苗外源病原檢測項目有。
1 無菌檢驗或純粹檢驗
1.1 無菌檢驗
厭氧性及需氧性細菌的檢驗用硫乙醇酸鹽培養基(T.G) 及酪胨瓊脂(G.A);霉菌及腐生菌檢驗用葡萄糖蛋白胨培養基(G.P)。
1.2 滅活檢驗
用適于本菌生長的培養基或對本毒敏感的細胞、組織和動物。
1.3 檢驗方法及結果判定
(1)含甲醛、苯酚、汞類等防腐劑和抗生素的制品用T.G 培養基 50ml,接種樣品 1ml (凍干制品先用 5ml 生理鹽水稀釋), 置37℃培養,3 日后自小瓶中吸取培養物分別接種T.G 小管和G.A 斜面各2 支,每支0.2ml,1 支置37℃ ,1 支置25℃ ;另取0.2ml 接種1 支G.P 小管置25℃,均培養5 日,應無菌生長。
(2)細菌性活疫苗及不含防腐劑、抗生素的其它制品或稀釋液將樣品直接接種T.G 小管和G.A 斜面各2 支,每支0.2ml, 1 支置37 ℃ ,1 支置25℃ ;另取0.2ml 接種1 支G.P 小管置25℃,均培養5 日,細菌性活疫苗應純粹,其他制品應無菌生長。
2 雜菌計數
2.1 樣品稀釋
隨機抽取3 瓶試驗樣品,用酒精棉消毒瓶塞后加入TSB 培養基對疫苗進行稀釋,最終使接種疫苗稀釋液為10 羽份/0.3ml。
2.2 接種
取10 塊GA 培養基平皿,在平皿上做好標記,每個樣品接種3 個平皿,每平皿接種0.3ml,傾斜平皿讓接種物均勻分布到瓊脂表面,設一陰性對照。置37℃培養箱培養48h 后轉移至25℃培養箱內培養24h。
2.3 計數
將培養結束的平皿取出,分別計算雜菌數,如果污染霉菌亦作為雜菌計數。根據平皿上的細菌數和霉菌數以及每塊平皿上接種的疫苗羽份數量,用下面的公式計算每個樣品每羽份所含的雜菌數。
每羽份雜菌數(雜菌數/ 份數)=
S1、S2、S3: 為第一、二、三塊平皿雜菌數。D :為每塊平皿上接種的疫苗雜菌數。
2.4 結果判定
陰性對照平皿無菌生長,實驗有效。任何一瓶待檢樣品每羽份疫苗雜菌不超過1 個為合格,3 個樣品中任何一個樣品每羽份雜菌計數超過1 個菌,則該產品不合格。
3 外源病毒檢驗—雞胚法
3.1 檢測方法
(1)雞胚檢測法分為:絨毛尿囊膜接種(CAM)和尿囊腔接種(AS)。
(2)雞檢查法:用雞胚檢測無結果或可疑時,可用雞檢1 次,檢查臨床反應及某些病原的抗體反應。
3.2 外源病毒檢驗時樣品稀釋的稀釋與中和
每批疫苗取樣2 瓶,將待檢樣品稀釋成每毫升含250 羽份(1000 羽份疫苗加入4ml 無菌PBS 溶液),混合2 瓶疫苗稀釋液, 取出 1ml (250 羽份),加入 3ml 相應的抗血清,室溫中和 1h,接 種前再加入1ml PBS 使總體積為5ml。如為聯苗則需加入每種抗血清各2ml 中和1h。
3.3 接種
雞胚源疫苗與相應抗血清混合室溫中和1h 后,取9-11 日齡SPF 雞胚10 只,通過CAM 和AS 2 個途徑分別接種雞胚10 只,每胚接種0.2ml。放置孵化機中孵化7 天,24h 內死亡雞胚不計,孵化7 天后每組至少存活8 個胚試驗才有效。
3.4 結果判定
7 天后,打開所有雞胚(包括24h 后死亡雞胚)進行解剖觀察,雞胚發育正常,絨毛尿囊膜無病變,尿囊液HA 為陰性。則檢驗樣品合格。如果因為外源病毒引起雞胚死亡或病變,則該批疫苗不合格。
4 外源病毒檢驗—RT-PCR 檢測方法
4.1RNA 的抽提
按照RNA 抽提試劑盒說明書進行
4.2RT-PCR 反應液的配制
反應體系:使用TaKaRa PrimeScript One step RT-PCR Kit Ver.2(TaKaRa Code :DRR055A)PCR 試劑盒,反應體系為25ul 體系,具體如下:PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1ul ;2×1 Step Buffer 12.5ul ;S1、S2 各1ul ;模板RNA 3ul ;Rnase Free 6.5ul。
4.3RT-PCR 反應程序
逆轉錄:50℃ 30min;預變性:92℃ 4min;擴增30 個循環(包括:變性:94℃ 30sec ;退火:55℃ 30sec ;延伸:72℃ 45sec); 最后延伸72℃ 10min。
4.4 瓊脂糖凝膠電泳
(1)用1×TAE 緩沖液配制瓊脂糖凝膠:準確稱取瓊脂糖1g,加入100ml 1×TAE 緩沖液。在微波爐上加熱至沸騰,待冷卻至60℃左右時,加入1ul Gold View,搖勻;將凝膠倒入預先準備好的制膠板上,置室溫冷卻待用。
(2)取PCR 產物(5~10ul)與Loding Buffer 按使用比例混合均勻后加至樣品孔中,其中一孔加入Maker,然后進行電泳,電壓為80V,電泳時間約為30~45min ;取出凝膠在紫外燈下觀察結果。
目前,國內禽用疫苗生產廠家的生產能力良莠不齊,生產疫苗所用的原料來源不清,疫苗出廠時把關不嚴,導致大量的問題疫苗流入市場。據中國獸醫藥品監察所1996 ~ 2000 年對666 批禽疫苗進行抽檢,合格率僅為85%。近年來,我國一些雞群在免疫禽用活疫苗后發生了腫瘤病,這是否與疫苗污染腫瘤病毒有關,特別是與制苗所用雞胚受到外源病原的污染有關。因此,疫苗的安全性檢測至關重要,應引起各方的重視,其檢測方法,應在各養殖場廣泛推廣使用,為防止問題疫苗流入市場, 杜絕問題疫苗造成養禽業的損失發揮應有的作用,保證養禽業穩步高效的發展。
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