赤水金釵石斛rDNA ITS序列分析

【摘要】  　　目的： 對(duì)赤水金釵石斛ITS序列進(jìn)行序列測(cè)定與分析，探討赤水金釵石斛在ITS片段上的遺傳特征，提高道地藥材赤水金釵石斛在分子水平的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。方法： 用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用雙脫氧終止法(Sangerdideoxy)測(cè)序。 結(jié)果： 通過(guò)與基因庫(kù)登錄的金釵石斛ITS對(duì)照，赤水金釵石斛ITS1與ITS2序列的起止范圍分別為1～231 bp和395～636 bp。赤水金釵石斛在8位缺失堿基C，在12位缺失堿基A，在82位為堿基A；據(jù)此，以NJ法（鄰接法）構(gòu)建了系統(tǒng)樹(shù)。測(cè)序結(jié)果登錄基因庫(kù)，序列號(hào)：EF618732。結(jié)論： 金釵石斛ITS1序列基因多態(tài)性比ITS2序列更顯著；該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為道地藥材赤水金釵石斛的物種鑒定補(bǔ)充了新的遺傳數(shù)據(jù)。

【關(guān)鍵詞】  赤水； 金釵石斛； rDNA ITS

　　［Abstract］Objective: To study the genetic character of ITS sequence of Chishui D.nobile and obtain a good molecular marker for authentication of Chishui D.nobile, the rDNA ITS region sequences were investigated by the methods of DNA sequencing.Methods： The nuclear ribosomal ITS was amplified with primes P1 and P2，and then send the products to the sequencing company.  Results： By contrasting with Genbank, sequence analysis showed that the range of ITS1 was from 1 to 231, ITS2 from 395 to 636.Base C in site 8, Base A in site 12, Base A in site 82,were missed in ITS sequence of Chishui D.nobile. According the result,phylogenetic tree based on ITS sequences data was reconstructed by Neighbor joining method. The result of sequencing has been submitted to Genbank.Accession number is EF618732. Conclusion： The sequence of ITS1 contained more variable sites and potential informative sites than that of ITS2 among D.nobile species. By our result for Chishui D.nobile,New genetic data were also supplied to authenticate chishui D.nobile.

　　［Key words］Chishui；  Dendrobium nobile;   rDNA internal transcribed sequence

    金釵石斛為傳統(tǒng)名貴中藥材，藥用歷史悠久，在《神農(nóng)本草經(jīng)》被列為上品，并收載于2000年版的《中國(guó)藥典》中，有“益胃生津、滋陰清熱、明目利嗓”等作用。2006年3月23日，國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局批準(zhǔn)對(duì)赤水金釵石斛實(shí)施地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)，認(rèn)定金釵石斛為赤水道地藥材。伴隨著金釵石斛藥用價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值的不斷提高，市場(chǎng)上的混淆品、假冒品不斷涌現(xiàn)且屢禁不止。另一方面，在中藥加工炮制的過(guò)程中中藥材的成分也會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致傳統(tǒng)的中藥材鑒定方法如性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定結(jié)果不穩(wěn)定。這就迫使人們必須加強(qiáng)金釵石斛真品的鑒別。快速論文發(fā)表
   
　　ITS（internal transcribed sequence）序列長(zhǎng)度適中，從人類到酵母的各種真核生物中它的序列長(zhǎng)度為1 000 bp到小于300 bp大小不等，人們可以從不太長(zhǎng)的序列中獲得足夠的信息，可廣泛用于屬內(nèi)種間或種內(nèi)群體的系統(tǒng)學(xué)研究［1］。日漸成熟的rDNA片斷序列分析技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥材的道地性鑒定,如太子參、杜仲、鐵皮石斛［2］、澤瀉［3］等的DNA分子鑒定。

    本實(shí)驗(yàn)用改良CTAB法［4.5］提取赤水金釵石斛DNA，并利用兩個(gè)石斛ITS區(qū)特異引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到ITS片段，純化PCR產(chǎn)物，用雙向直接測(cè)序和克隆測(cè)序獲得其ITS序列信息，對(duì)兩種測(cè)序方法所得序列與基因庫(kù)中已登陸金釵石斛序列進(jìn)行比較分析。確定赤水金釵石斛與其他地方石斛ITS序列差異，為赤水道地藥材金釵石斛提供分子鑒別資料。
   
　　1  材料和方法

　　1.1  樣本來(lái)源

    金釵石斛共50株，采自赤水長(zhǎng)期鎮(zhèn)、官渡、石堡鄉(xiāng)。

　　1.2  赤水金釵石斛總DNA提取及檢測(cè)（改良CTAB法）

    參照改良CTAB法［4］提取金釵石斛DNA，總DNA純度及濃度的檢測(cè)用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法。

　　1.3  PCR擴(kuò)增金釵石斛ITS序列（包括5.8 S）及產(chǎn)物回收

    ITS 的擴(kuò)增引物參照Douzery等［6］的引物設(shè)計(jì)P1,上游引物：5′�睠GTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC��3′, 位于18S 上；P2，下游引物：5′�睺TATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG��3′，位于26S 上；采用標(biāo)準(zhǔn)的雙鏈PCR 反應(yīng)擴(kuò)增核基因的整個(gè)ITS 片段(5′18S �� 3′26S,包括5.8S 編碼區(qū))，為了保證測(cè)序準(zhǔn)確性，我們選取了高保真的DNA聚合酶。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性1 min，56 ℃退火45 s，72 ℃復(fù)性2 min，循環(huán)30 次，然后72 ℃保溫8 min，反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物置4 ℃保存。與已登錄基因庫(kù)石斛屬ITS序列（包括5.8 S）對(duì)照，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，以Takara 50 bp DNA ladder標(biāo)準(zhǔn)參照物作為相對(duì)分子質(zhì)量參照，按照UNTQ��10柱式脫氧核糖核酸凝膠回收試劑盒說(shuō)明書回收目的基因。

　　1.4  赤水金釵石斛PCR回收產(chǎn)物直接測(cè)序

    將回收的PCR產(chǎn)物片段樣品送上海生工生物工程公司直接測(cè)序。所用測(cè)序儀器為ABI PRISM 3730，測(cè)序試劑為BigDye terminator，測(cè)序引物為特異引物P1和P2。

　　1.5  赤水金釵石斛PCR回收產(chǎn)物克隆及測(cè)序

    由于用高保真的DNA聚合酶所得的PCR產(chǎn)物為平末端，不能直接用于T�睞克隆，所以要經(jīng)過(guò)：PCR回收產(chǎn)物加“A” 尾；與PMD18�睺載體的連接；重組載體的轉(zhuǎn)化、篩選克隆；小量提取質(zhì)粒；菌落PCR、質(zhì)粒PCR鑒定克隆子；質(zhì)粒的純化鑒定步驟后將已純化的重組質(zhì)粒送上海生物工程公司測(cè)序。

　　1.6  直接測(cè)序與克隆測(cè)序結(jié)果分析

    用ClustalX1.83軟件對(duì)序列進(jìn)行對(duì)位排列,手工適當(dāng)校正以盡量減少排列所需缺失的數(shù)目,得到的序列用MEGA 3.1 分子進(jìn)化遺傳分析軟件分析。在以公式p=ndn（其中n為所測(cè)定序列的核苷酸數(shù),nd為核苷酸差異數(shù)）計(jì)算遺傳距離的基礎(chǔ)上，以鄰接法建立分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信度用自舉檢驗(yàn)法（bootstrap）檢驗(yàn),共進(jìn)行2 000次循環(huán)。

　　2  結(jié)果

　　2.1  ITS序列擴(kuò)增及克隆子的PCR檢測(cè)

　　2.1.1  ITS序列擴(kuò)增

　　在以特異引物作為PCR反應(yīng)引物的條件下，所得的條帶約在750 bp處，條帶清楚，方便PCR產(chǎn)物的回收、純化（圖1）。

　　2.1.2  菌落PCR、質(zhì)粒PCR鑒定重組質(zhì)粒

　　在以P1，P2作為引物的條件下，進(jìn)行菌落PCR和質(zhì)粒PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可以看出，所得序列約在750 bp左右，可以確定克隆成功（圖2）。

2.2  赤水金釵石斛測(cè)序結(jié)果及分析

    用ClustalX軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果比對(duì)，發(fā)現(xiàn)50株赤水金釵石斛ITS序列（包括ITS1，ITS2與5.8S）完全一致。赤水金釵石斛在8位缺失堿基C，在12位缺失堿基A，在82位為堿基A；來(lái)自云南麗江和來(lái)自海南的金釵石斛株在30位為T，在204位為G。克隆測(cè)序結(jié)果與直接測(cè)序結(jié)果完全一致（圖3）。測(cè)序結(jié)果已登錄基因庫(kù)，序列號(hào)：EF618732。1～5分別為以質(zhì)粒、菌落為模板擴(kuò)增的ITS序列；M: DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物DL2000快速論文發(fā)表

　　2.3  構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)

    根據(jù)不同地區(qū)金釵石斛測(cè)序結(jié)果計(jì)算其遺傳距離；用MEGA軟件以NJ法（鄰接法）構(gòu)建了系統(tǒng)樹(shù)（圖4）。

　　3  討 論

    由于ITS片段在核基因組內(nèi)是高度重復(fù)的,不同重復(fù)序列間的純合程度可能不同。通過(guò)不等交換和基因轉(zhuǎn)換，核rDNA 重復(fù)單位間已經(jīng)發(fā)生了位點(diǎn)內(nèi)或位點(diǎn)間的協(xié)同進(jìn)化，即不同拷貝的序列趨于相近或完全一致，這就為對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序奠定了理論基礎(chǔ)。但如果rDNA重復(fù)序列間的純合程度較低，各重復(fù)單位間序列差異較大，特別是當(dāng)細(xì)胞中有一個(gè)以上的基因位點(diǎn)時(shí)，直接測(cè)定PCR產(chǎn)物的序列，可能導(dǎo)致讀不出序列，只測(cè)一個(gè)PCR產(chǎn)物的克隆序列也不能較好反映重復(fù)序列間的變異。另一方面，如果PCR產(chǎn)物中不同重復(fù)序列的濃度比較平均的話，直接測(cè)序可直接確定重復(fù)序列間的變異情況，因?yàn)榘l(fā)生變異的核苷酸會(huì)在同一位點(diǎn)上顯示出來(lái)。為了得到準(zhǔn)確的赤水金釵石斛ITS序列的信息，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)當(dāng)中分別采用了PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法和克隆測(cè)序法，通過(guò)對(duì)兩種測(cè)序結(jié)果的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)兩種測(cè)序方法所得ITS序列一致。說(shuō)明赤水金釵石斛rDNA 重復(fù)序列間的純合程度很高，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序就可以反映出ITS區(qū)的序列。本試驗(yàn)通過(guò)克隆測(cè)序驗(yàn)證了這一結(jié)論，而且更進(jìn)一步說(shuō)明赤水金釵石斛進(jìn)化穩(wěn)定，在赤水地區(qū)，金釵石斛種群沒(méi)有突變位點(diǎn)。可將本次實(shí)驗(yàn)測(cè)序結(jié)果作為赤水道地藥材金釵石斛的分子標(biāo)記。

    根據(jù)赤水金釵石斛的測(cè)序結(jié)果，并與基因庫(kù)登錄的金釵石斛ITS對(duì)照，赤水金釵石斛ITS1與ITS2序列的起止范圍分別為1～231 bp和395～636 bp。赤水金釵石斛在8位缺失堿基C，在12位缺失堿基A，在82位為堿基A；聚類分析圖，可以看出赤水金釵石斛與其他地區(qū)金釵石斛存在個(gè)別堿基差異，在遺傳距離0.000 5處，可將6個(gè)不同地區(qū)的金釵石斛分為6個(gè)聚類群，其中云南和海南金釵石斛聚在一枝，可能是由于兩個(gè)地方都是亞熱帶氣候，導(dǎo)致他們進(jìn)化一致。可以得出：（1）金釵石斛ITS1序列基因多態(tài)性比ITS2序列更顯著。（2）本研究結(jié)果為赤水金釵石斛鑒定提供了新的分子依據(jù)、補(bǔ)充了新的遺傳數(shù)據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】
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