大鼠島葉與杏仁核電點燃癲癇模型的相關性研究

【摘要】  目的 電刺激Sprague-Dawley大鼠島葉、杏仁核及同時刺激島葉、杏仁核建立復雜部分性癲癇模型，探討島葉癲癇的可能發病機制。方法 健康雄性SD大鼠60只，隨機分成三組：島葉點燃組(IK)、杏仁核點燃組(AK)、島葉杏仁核同時點燃組(BK)。分別將雙極電極植入左側島葉、左側杏仁核和同時植入島葉杏仁核；測定后放閾后每日給予兩次電刺激，刺激參數：強度為后放閾1.5倍，頻率60 Hz，波寬1 ms，持續時間1 s。結果 島葉組和杏仁核組后放閾值差異有統計學意義(P＜0.05)；三組點燃時間差異有統計學意義，島葉組點燃最快，島葉杏仁核同時點燃組點燃最慢(P＜0.05)；三組點燃率無明顯差異。結論 島葉是一個癲癇癥狀發作區；島葉癲癇的發生、發展與杏仁核點燃存在差異；同時點燃表現為點燃的拮抗作用。

【關鍵詞】  島葉；杏仁核；點燃；癲癇模型

　　Abstract: Objective  To stimulate Sprague�睤awley Rat Insular, Amygdale or  to stimulate insular and amygdale simultaneously and  to establish Complicated Partial Epilepsy Model for investigating possible nosogenesis of Insular Epilepsy. Methods   60 male Sprague�睤awley Rats were divided into 3 groups randomly: Insular kindling group (IK), Amygdale kindling group (IK), Insular and amygdale simultaneously kindling group (BK). Bipolar electrodes were implanted into left Insular or left Amygdale or both and rats were stimulated at 1.5 times of afterdischarge threshold twice daily. Stimulus train consisted of 1�瞞s (square biphasic) pulses at 60 Hz, with train duration of 1s. Results  There was significant difference in the aftercharge threshold between insular and amygdale kindling groups (P＜0.05). There was significant deviation  at kindling speed among three groups: IK was the most rapid kindling group and BK group was kindled more slowly (P＜0.05). There was no significant difference in kindling rate among three groups. Conclusion  Insular is an area that  causes epilepsy symptom. The genesis and development of Insular Epilepsy are different from Amygdale Epilepsy and it shows antagonism to kindling.

　　Key words: insular; amygdale; kindling; epilepsy model電子商務論文發表

　　癲癇是常見的腦部發作性疾病，而島葉癲癇由于位置深在、診斷困難、機制不清等原因成為最難處理的一類癲癇。島葉在癲癇(特別是顳葉癲癇)中的作用，在國際上已逐漸被一些學者重視［1］。而在國內,除少量有關島葉占位性病變引起癲癇發作的病例報道外,此方面的研究報道很少。電點燃模型是研究顳葉癲癇最理想的模型，它通過反復刺激特定腦區導致其癲癇發作活性不斷增強， 最終形成穩定的癲癇發作狀態［2］。本研究試圖通過電刺激Sprague-Dawley大鼠島葉、杏仁核及同時刺激島葉杏仁核建立復雜部分性癲癇動物模型，觀察三者在后放閾、點燃時間和觸發閾值上的差異，并分析出現此種差異的可能原因，探討島葉在癲癇中的發病機制。

　　1  材料和方法

　　1. 1  實驗動物及分組

　　6～8周齡雄性Sprague-Dawley大鼠60只（寧夏醫科大學實驗動物中心提供），體重250～300g，單籠飼養，隨機分為島葉組(IK)、杏仁核組(AK)和島葉杏仁核同時點燃組(BK)，每組20只。

　　1.2  實驗儀器
 
　　Alpha-Lab多通道生理記錄儀(ALAB000153， Israel)；腦立體定位儀(SR-5R， Japan)；生物電子刺激器(AM2100，USA)；ZH-RXZ 柔性顱骨鉆(DIAMOND JEWELRY MADE BY ELECTRIC CO U.S.A) ；漆包鎳鉻電極(上海鼎阜金屬材料有限公司)； 冷光四孔手術無影燈(廣東汕頭醫療器械廠)；CH2510型三孔接插件(寧波儀器廠)。

　　1.3  動物模型的制備與實驗

　　0.5%戊巴比妥鈉(65mg/kg)麻醉大鼠，固定大鼠頭部于腦立體定向儀，75%酒精局部消毒皮膚，正中切口約1 cm，剪除部分皮膚、皮下組織和骨膜，暴露顱骨及前后囟，創面止血。枕頂骨區、額骨區安放4～5個加固螺釘，枕骨區加固螺釘兼做接地電極。 立體定位［3-4］：島葉（前囟前1.2mm；旁開5.5mm；硬膜下5.5mm）；杏仁核（前囟后2.8mm；旁開4.9mm；硬膜下8.6mm）右額（前囟前1.5mm;旁開1.5mm；硬膜下0.5mm）；左側小腦（前囟后12mm;旁開3.0mm；硬膜下4.0mm）。雙極電極安放于島葉和杏仁核，作為刺激電極；單級電極安放于右額和左側小腦，分別作為皮層記錄電極和參考電極。所有電極均由三孔接插件引出,并用牙科水泥將接插件固定在顱骨表面。
   
　　術后觀察大鼠呼吸、心率、體溫、血壓和膚色，0.5h后各項指標均屬正常，將鼠放回飼養籠，保證各鼠的單籠飼養；術后連續3 d腹腔注射青霉素鈉5萬U/d；2周后開始點燃實驗，先測大鼠島葉和杏仁核的后放電閾值，用A-M SYSTEMS 2100刺激器給大鼠持續電流刺激，脈沖為雙向方波，波寬1．0 ms，頻率60 Hz，持續1 s。島葉刺激強度開始為100μA，以后每隔90 s增加20μA，杏仁核刺激強度開始為40μA，以后每隔90 s增加10μA，直到EEG記錄到≥3s的后發放電，為該大鼠的ADT。島葉杏仁核組分別測得島葉和杏仁核的ADT。

    從測定ADT的第一天起, 每天按ADT 1.5倍強度刺激2次，刺激間隔大于1h，直至出現5次Ⅴ級發作，視為點燃成功。發作強度按Racine分級評分［5］：Ⅰ級：不動、閉眼，面肌輕微痙攣；Ⅱ級：點頭；Ⅲ級：單側前肢陣攣；Ⅳ級：雙前肢陣攣；Ⅴ級：全身陣攣發作。且定時進行行為學以及自由活動狀態下腦電圖監測。

    實驗結束時，各組大鼠戊巴比妥過量麻醉，經左心灌注取腦，4％多聚甲醛后固定，蔗糖脫水，液氮中OCT包埋后保存于-80℃冰箱中。美國LEICA恒低溫切片機行全腦冠狀冰凍切片，片厚14μm，鑒定電極位置。

　　1.4  統計學方法

　　分別比較島葉和杏仁核點燃組及同時點燃組在ADT、點燃速度、發作強度和觸發閾值的差異。兩個樣本均數之間的比較采用t檢驗，P＜0.05為有統計學意義，統計軟件采用SPSS 11.5。
　　
　　2  結果

　　2.1  本實驗中記錄的大鼠腦電圖  見圖1-3。

　　2.2  點燃特征

　　全部測量來源于自由活動大鼠。除去組織學證實未植入島葉或杏仁核的大鼠。島葉與杏仁核的ADT、大發作觸發閾值、點燃時間差異有統計學意義(P＜0.05)；島葉組和杏仁核組大發作持續時間差異無統計學意義；島葉杏仁核同時點燃組與島葉組、杏仁核組點燃時間有統計學意義(P＜0.05)。表1  三組大鼠后放閾值、點燃時間、癲癇大發作觸發閾值及癲癇大發作持續時間比較(略)

　　3  討論電子商務論文發表

    在各種癲癇的動物模型中，點燃模型是目前應用最廣泛的動物模型，目前已用于癲癇各方面的研究［2］。電點燃是以同等強度的閾下刺激在一定的時間間隔下重復刺激動物邊緣腦區的某一部位，導致癲癇活動強度逐漸增加，最終出現全身性癲癇發作。動物點燃形成后具有如下特征：①即使不再給予刺激，異常的EEG規律性放電可維持一年以上，且再次電刺激引起陣攣性發作；②少數動物可自發性發作；③放電通過突觸間隙傳遞；④其癲癇發作行為類似于人類的復雜部分性發作伴繼發性全身痙攣性發作；⑤發作時EEG異常類似于人類的復雜部分性發作間期杏仁核和海馬結構電極描記的結果［5］。
    島葉是人腦的第五葉，外科醫生常發現在顳葉切除術后，皮層腦電圖所顯示的切除后殘留棘波常起源于島葉，這提示島葉具有致癇潛能，由于難以區別癲癇發作是起源于顳葉內側后迅速擴展至島葉，還是起源于島葉然后擴散至顳葉的，所以常難以證實其為一獨立癇灶［6］。

 在20世紀40年代末50年代初， Guillaume［7］提出島葉癲癇的概念，但是由于以上原因，一直沒有證實島葉是一個獨立的癲癇發作區。最近一些學者認為，正如許多其他的部分性癲癇發作類型一樣，當島葉皮質被作為一個部分被涉及或作為一個單純的癲癇起源，而不單單是一個癲癇傳播的中轉結構時，癲癇體系的概念可以描述為島葉癲癇［8］。在這個癲癇體系中，可能有三種傳播方式［9-10］：即顳-外側裂-島葉體系，主要包括環繞島葉的額、頂和顳部島蓋；顳-邊緣-島葉體系，主要包括顳葉內側結構和(或)顳極；內側-眶額-島葉體系，主要包括島葉內側、眶額。但島葉在這三種方式中具體起什么作用；在大腦皮質、顳邊緣系統、島葉間癲性放電是如何傳播的等諸多問題都未見相關文獻報道。

    本次實驗成功建立島葉電點燃癲癇模型，并成功記錄到自由活動大鼠安靜狀態下和癲癇發作時島葉、杏仁核和皮層的腦電變化。癲癇發作時，島葉、杏仁核和皮層都記錄到癲癇波。在IK組,共有18只大鼠獲得完全點燃，一只電極脫落，一只未點燃，平均刺激(7.52±2.31)d,點燃成功率為90%。在AK組，共有17只大鼠獲得完全點燃，2只電極脫落，一只未點燃，平均刺激（11.26±3.68）d，點燃成功率為85%。IK和AK組相比，對于誘發癲癇發作最敏感的參數AD而言，IK組顯著高于AK組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，但點燃速度IK組與AK組相比顯著增快(P＜0.05)，這說明了在點燃的敏感程度上，島葉與杏仁核相比欠敏感，但在癲癇發生、發展過程中，島葉又比杏仁核明顯增強，這也進一步證實了島葉癲癇并不是僅僅以島葉-杏仁核-海馬復合體而發生的。島葉癲癇可能通過顳-外側裂-島葉體系、顳-邊緣-島葉體系和內側-眶額-島葉體系的某一種體系或幾種體系同時進行傳播，這也可以解釋為什么島葉癲癇在發生、發展過程中較杏仁核點燃相對較快的原因。

    基于此，我們進一步證實了島葉是一些癲癇發作的獨立致癲源，而不僅僅是顳葉癲癇傳播通路中的一個組成部分。其發作機制可能由于島葉癲癇灶部位的不同，通過以上三種不同的方式傳播。因島葉的廣泛的纖維聯系，也可能其他部位的癲癇灶波及島葉，島葉只是癲癇環路中的一部分。

    本次實驗BK組,所有的大鼠均發展為5級癲癇發作,點燃成功率為100%，平均刺激（17.71±5.24）d，最長20d,最短15d，與IK和AK組大鼠達到5級癲癇發作的刺激天數相比，BK組癇性發作出現的速度顯著減慢(P＜0.05)。其可能原因為BK方法不僅促進了點燃的發生發展，而且也促進了點燃的拮抗作用［11-12］。點燃的拮抗作用是一種正常點燃過程的終止。

    基于以上觀點我們可認為BK方法反映了興奮性和抑制性機制的增強。前者與點燃的泛化和自發性癇性放電的發生直接相關；而后者與某種類型的點燃拮抗作用有關，從而導致點燃的減弱。島葉杏仁核的相互拮抗作用也進一步證實，如解剖學研究顯示，島葉和杏仁核之間存在纖維聯系，島葉纖維還投射到海馬前部，在點燃的發生、發展過程中，島葉杏仁核之間存在著電活動，但島葉癲癇并不是僅僅通體海馬杏仁核而發生的。本實驗通過電刺激島葉建立了慢性癲癇點燃模型，我們進一步證實了島葉是一些癲癇發作的獨立致癇源，本身即具備致癇潛能，而不僅僅是顳葉癲癇傳播通路中的一個組成部分。島葉屬于旁邊緣系統，與環繞島葉的額、頂和顳部島蓋，顳葉內側結構和(或)顳極，島葉內側、眶額等顳邊緣系統有著復雜的纖維聯系，癲癇是朝著與致癲區有著解剖生理聯系的其他腦區傳播，而形成一個癲癇性神經網絡。但由于島葉位置深在、纖維聯系復雜等原因，島葉癲癇的致癇潛能、致癇機制，以及島葉與邊緣系統及旁邊緣系統等結構在癲癇發生、發展過程中的相互關系還需要進一步研究證實。

【參考文獻】
  　　［1］Duffau H, Capelle L, Lopes M, et al. Medically intractable epilepsy from insular low-grade gliomas: improvement after an extended lesionectomy ［J］. ActaNeurochir, 2002,144:563-572.

　　［2］Stables JP, Bertram EH, White HS, et al. Models for epilepsy and epileptogenesis: report from the NIH workshop, Bethesda, Maryland ［J］. Epilepsia, 2002,43 (11):1410-1420.

　　［3］L. LóPEZ-VEL?ZQUEZ, E AGUIRRE，RG PAREDES. Kindling increases aversion to saccharin in taste aversion learning ［J］. Neuro Science, 2007,144(7):808-814.

　　［4］Hal Blumenfeld, Maritza Rivera, J. Gabriel Vasquez, et al.Neocortical and Thalamic Spread of Amygdala Kindled Seizures ［J］.Epilepsia,2007,48(2):254-262.

　　［5］Loscher W,Rundfeldt C,Honack D.Pharmacological characterizationof phenytoin-resisant amygdale- kindled rats［J］.Neurology,1998,51:41-48.

　　［6］Schwartz TH.Insular seizures:have we been missing the boat? ［J］.Epilepsy Curr,2005,5(4):147-148.

　　［7］Guillaume MMJ, Mazars G, Mazars Y. Indications chirurgicales dans les épilepsies dites 'temporales' ［J］. Rev Neurol,1953,88:461-501.

　　［8］Williamson D, Engel J, Munari C. Anatomic classification of localization-related epilepsy// Engel J, Pedley T, eds. Epilepsy Lippincott-Raven,1997:2405-2426.

　　［9］Aghakhani Y, Rosati A, Dubeau F, et al. Patients with temporoparietal ictal symptoms and inferomesial EEG do not benefit from anterior temporal resection ［J］. Epilepsia,2004,45:230-236.電子商務論文發表

　　［10］Ryvlin P, Minotti L, Demarquay G, et al. Nocturnal hypermotor seizures, suggesting frontal lobe epilepsy, can originate in the insula ［J］. Epilepsia, 2006,47(4):755-765.

　　［11］Jun Lian, Marom Bikson, Christopher Sciortino, et al. Local Suppression of Epileptiform Activity by Electrical Stimulation in Rat Hippocampus In Vitro ［J］. Physiol,2003,547(Pt 2): 427-434.

　　［12］F. Le Jeune J， Péron I，Biseul, et al. Subthalamic nucleus stimulation affects orbitofrontal cortex in facial emotion recognitiona pet study［J］. Brain,2008, 131(6): 1599-1608.