無精、嚴重少精癥患者細胞遺傳學和Y染色體微缺失研究

【摘要】  目的 探討無精、少精及嚴重少精癥與染色體核型異常和Y染色體無精子因子(AZF)微缺失的關系。方法 采用常規(guī)外周血淋巴細胞染色體制備方法和多重聚合酶鏈反應技術，對136例(無精癥98例，少精癥24例，嚴重少精癥14例)男性不育患者進行細胞遺傳學和分子遺傳學檢測。結果 染色體異常檢出率為25%(34/136)，其中無精癥占19.9%(27/136)，少精癥占2.2%(3/136)，嚴重少精癥占2.9%(4/136)；Y染色體AZF缺失率6.6%(9/136)，其中無精癥占5.1%(7/136)，嚴重少精癥占1.5%(2/136)。結論 染色體異常和Y染色體微缺失是男性不育的主要遺傳因素，Y染色體異常與AZF缺失之間有一定關系。

【關鍵詞】  無精癥；嚴重少精癥；染色體異常；AZF微缺失

　　Abstract: Objective  To investigate the relationship between chromosome abnormalities and Y chromosome microdeletion of azoospermia factor (AZF) in patients with azoospermia and oligozoospermia. Methods    Both routine periphearl blood lymphocytes cytogenetic analysis and detection of AZF region microdeletion of Y chromosome by multiplex PCR were carried out in 136 infertile men, including 98 patients with azoospermia, 24 patients with oligozoospermia and 14 patients with sever oligozoospemia. Results   Chromosomal abnormalities were found in 34(25%) cases including 27 azoospermia, 3 oligozoospermia and 4 severe oligozoospermia. Microdeletions in AZF region were found in 9 ( 6.6% ) cases. The incidence of AZF microdeletion was 5.1% and 1.5% in patients with azoospermia and severe oligozoospermia respectively. Conclusion  The findings indicated that chromosomal abnormality and AZF microdeletion might be important genetic causes for male infertility. AZF microdeletion might be associated with Y chromosome abnormalities.水利論文發(fā)表

　　Key words：azoospermia; severe oligozoospermia; chromosome abnormality; azoospermia factor microdeletion

　　育齡夫婦中約10%～15%患有不育(WHO 1987)，而由男性因素引起的不育約占這一比例的50%［1］。男性不育的病因復雜，較常見的有感染性、器質(zhì)性和遺傳因素等。遺傳因素(染色體異常、Y染色體微缺失和基因突變等)所引起的精子發(fā)生障礙約占男性不育病因的30%［2］。染色體核型異常是目前證實的男性不育的常見遺傳病因之一。隨著Y染色體長臂1區(qū)1帶的無精子因子(azoospermia factor, AZF)的發(fā)現(xiàn)，Y染色體微缺失與男性不育的關系日益受到重視。本研究對無精、少精及嚴重少精癥患者進行了染色體和AZF缺失性檢測，分析其與男性不育的關系，并初步探討Y染色體異常與AZF缺失之間的關系。

　　1  材料與方法

　　1．1  研究對象

　　136例無精、少精、嚴重少精患者來自寧夏醫(yī)科大學遺傳咨詢門診，年齡19～44歲，平均年齡(28.7±4.5)歲，所有患者均結婚2年以上，女方婦科檢查正常，并未采取任何避孕措施而其妻不能受孕，不孕時間為2～7年。精液分析及無精癥、少精癥、嚴重少精癥診斷,按世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦方法和診斷標準進行［3］，即連續(xù)2次精液檢查分析并經(jīng)離心沉淀均無精子者為無精癥，精子密度＜20×106/mL者為少精癥，精子密度＜5.0×106/mL者為嚴重少精癥。所檢136例患者中，無精癥98例、嚴重少精癥14例、少精癥24例。另外選擇5例已正常生育的男性為對照。

　　1．2  細胞遺傳學檢查

　　取外周血3mL，經(jīng)肝素抗凝后進行常規(guī)淋巴細胞培養(yǎng)，染色體制備，G顯帶。每例分析20個中期分裂相，3～5個G顯帶核型，核型異常者加倍分析或輔做C顯帶分析。

　　1．3  Y染色體AZF缺失性檢測

　　1．3．1  DNA提取

　　抽取外周血3mL，EDTA抗凝。嚴格按照全血細胞DNA提取試劑盒(H.Q.&.Q.Blood DNA Kit，安徽優(yōu)晶生物工程有限公司生產(chǎn))說明進行DNA提取，-20℃保存。

　　1．3．2  AZF缺失性檢測

　　Y染色體微缺失檢測試劑盒購自上海透景生命科技有限公司，根據(jù)歐洲男科協(xié)會(European Academy of Andrology, EAA)和歐洲分子遺傳實驗預控網(wǎng)(European Molecular Genetics Quality Network, EMQN)檢測指南推薦方法進行多重聚合酶鏈反應(multiplex PCR)。每次實驗均以無菌蒸餾水和位于Y染色體短臂(Yq)的睪丸決定基因(SRY)為內(nèi)對照，并選擇正常生育男子DNA樣品為陰性對照。每個AZF區(qū)域設置2個序列標簽位點(STS)。AZFa為SY84、SY86；AZFb為SY127、SY134；AZFc為SY254、SY255。所有DNA樣品均經(jīng)2次多重PCR完成，稱為Multiplex A和B，每次多重PCR均包括AZFa、b、c區(qū)域的STS和對照基因引物。在Multiplex A中完成SRY、SY254、SY86、SY127的擴增；在Multiplex B中完成SRY、SY84、SY134、SY255的擴增。反應條件為：基因組DNA1μL，預混液10μL，引物混合液9μL，體系為20μL。擴增條件為：95℃ 3min，95℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 30s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物8μL加2μL 6×上樣緩沖液，充分混合均勻后經(jīng)3.0%瓊脂糖凝膠電泳(恒壓130V)40min，用Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)進行DNA電泳條帶的觀察。

　　2  結果

　　2．1  細胞遺傳學檢測結果

　　136例無精、少精及嚴重少精癥患者中共發(fā)現(xiàn)染色體明顯異常34例，異常檢出率為25% (34/136)，其中11例為Klinefelter's syndrome (47, XXY)，占異常檢出率的8.09% (11/136)；46, XY (大Y，Y ≥18)患者10例，占異常檢出率的7.35% (10/136 )；46, XY (小Y，Y ≤21)患者10例，占異常檢出率的7.35% (10/136)；47, XYY患者1例，占0.74% (1/136)；46, XY (47, XYY，-9+?)患者2例，占1.47% (2/136)。無精癥患者染色體異常檢出率為19.9% (27/136)；少精癥患者異常檢出率為2.2% (3/136)；嚴重少精癥患者異常檢出率為2.9% (4/136)。結果見表1。表1  無精、少精及嚴重少精癥患者染
色體核型分析結果(略)

　　2．2  AZF缺失性檢測結果

　　136例無精、少精及嚴重少精癥患者中共發(fā)現(xiàn)Y染色體AZF微缺失9例，總缺失率為6.6%(9/136)，其中無精癥患者AZF微缺失7例，缺失率為5.1%(7/136)；嚴重少精癥患者缺失2例，缺失率為1.5%(2/136)。24例少精癥患者未發(fā)現(xiàn)AZF微缺失。9例微缺失患者AZF各區(qū)域缺失情況為AZFc微缺失5例，占總缺失的55.6%(5/9)；AZFa缺失2例(均為無精子癥患者)，占總缺失的22.2%(2/9)；AZFb+c缺失1例，占總缺失的11.1%(1/9)；AZFa+b+c缺失1例，占總缺失的11.1%(1/9)。四種缺失類型進行PCR擴增電泳檢測，結果見圖1。無精癥和嚴重少精癥患者AZF缺失情況見表2。表2  無精、少精及嚴重少精癥患者Y染色體AZF微缺失類型分析結果（略）

　　3  討論

    男性不育癥患者染色體異常檢出率一般在2.2%～33%之間［4］，本文異常檢出率為25%，結果與此相符。文獻顯示無精癥患者染色體異常頻率為13.7%～15.4%，嚴重少精癥患者染色體異常頻率為1.7%～4.6%［5］，本研究中無精癥患者異常率為19.9%(27/136)，少精癥患者異常率為2.2%(3/136)，嚴重少精癥患者異常率為2.9%(4/136)，與文獻報道基本相符，異常率略顯增高。本文核型異常者均為性染色體異常，異常類型主要有Klinefelter's syndrome(47,XXY)、大Y(Y≥18)和小Y(Y≤21)，且大多表現(xiàn)為無精癥。大Y和小Y通常被認為是染色體多態(tài)性變異，一般不會引起有害的遺傳學性狀。但是近來的研究表明，染色體多態(tài)性與生殖異常如男性不育、精子異常等有關，可以導致不同程度的臨床效應［6］。精子發(fā)生是一個持續(xù)性的分化過程，需經(jīng)2次細胞分裂，染色體數(shù)目減半，細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變等復雜的變化，多種因子在該過程中嚴格調(diào)控其表達，其中染色體異常尤其是性染色體的異常可能是導致男性不育的主要原因。

 Y染色體長臂AZF微缺失也被認為是引起男性生精障礙的另一個常見的遺傳病因。有關Y染色體微缺失頻率各地區(qū)報道不盡相同，缺失率從1%到55%各不相同［7］。本研究中總缺失率是6.6%。大約10%～15%的無精癥及5%～10%的嚴重少精癥患者表現(xiàn)有Y染色體微缺失［8］，本研究中無精癥患者缺失率5.1%(7/136)，嚴重少精癥患者缺失率1.5%(2/136)，缺失率相對較低，這可能與病例數(shù)量偏少有關。9例AZF微缺失患者中，AZFc缺失率最高(55.6%)，這與文獻報道相符。有報道顯示，AZFa缺失較罕見，本研究中AZFa缺失率22.2%，與文獻報道不符［9］，提示AZFa區(qū)可能是寧夏地區(qū)不育男性Y染色體AZF區(qū)域微缺失的次熱區(qū)。本研究中AZFa、AZFb缺失者均表現(xiàn)為無精癥，AZFc缺失者則表現(xiàn)為為無精癥和嚴重少精癥，與文獻報道一致。Taskiran等［10］認為，AZFa缺失表現(xiàn)為唯支持細胞綜合征，并伴有睪丸體積縮小，AZFb 缺失表現(xiàn)為精子成熟障礙，主要停留在精母細胞階段；Imken等［11］研究表明，AZFc缺失的病理表現(xiàn)從正常到無精子。Y染色體AZF微缺失的頻率、位置及程度有所不同可能與種族、地區(qū)性差異、遺傳多態(tài)現(xiàn)象有關，AZF微缺失的區(qū)域不同，患者所表現(xiàn)的臨床癥狀也不同，所以在不同地區(qū)進行Y染色體AZF微缺失的檢測具有重要的實際意義。水利論文發(fā)表

    本研究中9例Y染色體微缺失患者中有5例伴有染色體異常，其中1例是46, XY (大Y)，為AZFc缺失，臨床表現(xiàn)為無精癥；1例是46，XY (小Y)，為AZFc缺失，臨床表現(xiàn)為無精癥；另1例是46，XY (小Y，Y染色體僅有著絲粒)，為AZFa+b+c缺失，臨床表現(xiàn)為為無精癥；還有2例是46，XY (小Y，未見Y染色體異染色質(zhì)區(qū))，為AZFb+c缺失，臨床表現(xiàn)為無精癥和46，XY (小Y)，AZFc缺失，嚴重少精癥。本研究顯示細胞遺傳學異常時可檢出分子水平異常，兩者有一致性，進一步證實男性不育與染色體異常和Y染色體微缺失密切相關。細胞遺傳學和Y染色體AZF缺失分析對輔助生育技術的應用具有指導意義。由于KS患者及AZF基因缺失的個體不能象正常人那樣生育，必須通過輔助生育技術如ICSI而受孕，從而可能將引起精子發(fā)生障礙的基因缺陷如AZF缺失人為地遺傳給男性后代，因此在對生精障礙的患者進行ICSI治療之前有必要常規(guī)進行染色體分析和AZF基因缺失分析，對發(fā)現(xiàn)有缺失的患者，應向其說明產(chǎn)生具有相同缺失的男性后代的危險性。

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