低強度間斷負(fù)壓誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化

【摘要】  　　目的 利用低強度間斷負(fù)壓誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向成骨細(xì)胞定向分化。方法 分離人骨髓，利用梯度離心法進行MSCs的培養(yǎng)，取第三代細(xì)胞利用低強度間斷負(fù)壓誘導(dǎo)分化；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，檢測堿性磷酸酶(ALP)活性，茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成，免疫組織化學(xué)檢測Ⅰ型膠原和骨保護素的表達(dá)。結(jié)果 低強度間斷負(fù)壓誘導(dǎo)2周后，細(xì)胞呈現(xiàn)出成骨細(xì)胞形態(tài)，ALP活性明顯增強，茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)形成，Ⅰ型膠原和骨保護素表達(dá)陽性。結(jié)論 利用低強度間斷負(fù)壓可以成功的誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞定向分化，誘導(dǎo)的細(xì)胞具有典型的成骨細(xì)胞特性。

【關(guān)鍵詞】  負(fù)壓 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨細(xì)胞 誘導(dǎo)

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the effect of low-intensity interrupted negative pressure on the differentiation of human marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into osteoblast in vitro. Methods  MSCs were isolated from adult marrow using density gradient separation method, passage 3 cells were chosen to induce differentiation; the differentiation of MSCs was examined by phase-contrast microscopy, the determination of alkaline phosphatase (ALP) activities, alizarin-red staining and the immunohistochemistry of typeⅠcollagen and osteoprotegerin. Results  MSCs showed a typical appearance of osteoblasts after 2 weeks�� induction by low-intensity interrupted negative pressure, the activities of ALP were increased significantly, calcium nodes were seen by alizarin-red staining, the expressions of collagen typeⅠ and osteoprotegerin were positive. Conclusion  Low-intensity interrupted negative pressure could successfully induce human MSCs into osteoblasts and the induced cells show characteristics of osteoblasts.

　　KEY WORDS: negative pressure; marrow mesenchymal stem cell; osteoblast; induction

　　近年來，負(fù)壓封閉引流技術(shù)(vacaum assisted closure, VAC)在外科創(chuàng)面處理方面取得了巨大的成功，該項技術(shù)能改善創(chuàng)面血供促進創(chuàng)面愈合［1］。負(fù)壓技術(shù)對骨組織有何作用以及作用的機制如何，能否用來促進骨折愈合、治療骨壞死等方面，國內(nèi)外尚無學(xué)者對其進行研究。本研究在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上通過觀察低強度間斷負(fù)壓對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)誘導(dǎo)分化的影響，以闡述其作用機制，為今后在骨折愈合和骨壞死方面的研究提供理論依據(jù)。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料 教師論文發(fā)表

　　骨髓2例取自我科診斷為髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，行人工關(guān)節(jié)置換的手術(shù)患者，年齡分別為56歲和61歲。兩例患者肝腎功能正常，無代謝性骨病及傳染病，手術(shù)前經(jīng)患者同意，術(shù)中截骨后經(jīng)骨髓腔抽取骨髓5mL，吸入預(yù)先加有肝素的針筒備用。

　　1.2  主要試劑與儀器

　　L-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均為Gibco產(chǎn)品，Percoll分離液為Sigma產(chǎn)品(1.073 g/mL)，胎牛血清(杭州四季青)，Ⅰ型膠原和骨保護素免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，完全培養(yǎng)基的組成：L-DMEM培養(yǎng)基加入100 mL/L胎牛血清，青、鏈霉素終濃度為100 u/mL，微型負(fù)壓儀。

　　1.3  細(xì)胞原代培養(yǎng)

　　細(xì)胞采用梯度離心法進行培養(yǎng)：將抽取的骨髓分裝入離心管，加入 L-DMEM培養(yǎng)基2 mL，1 500 r/min離心5 min去除上層脂肪滴和上清，以D-Hank�餾液重懸細(xì)胞后平鋪于Percoll分離液上，1 500 r/min離心10 min，吸取中間層的白膜層(單核細(xì)胞層)，以D-Hank�餾液洗滌，加入L-DMEM培養(yǎng)基置入無菌培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))的CO2孵育箱培養(yǎng)。

　　1.4  負(fù)壓誘導(dǎo)  高級職稱論文發(fā)表
　　
　　取第三代細(xì)胞進行負(fù)壓誘導(dǎo)，把24孔和6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)液預(yù)先吸掉4/5，打開蓋置入自行設(shè)計的無菌密閉容器中，容器側(cè)面有孔和導(dǎo)管與微型負(fù)壓儀相連，打開負(fù)壓儀設(shè)置壓力為20 kPa，30 min/次，2次/d。每次誘導(dǎo)完畢后取出培養(yǎng)板補足培養(yǎng)液，實驗分為負(fù)壓誘導(dǎo)組和正常培養(yǎng)組。

　　1.5  細(xì)胞觀察

　　倒置顯微鏡下每日觀察細(xì)胞的生長情況和形態(tài)特點，拍照記錄。

　　1.6  堿性磷酸酶活性的測定

　　誘導(dǎo)2周后，兩組細(xì)胞用考馬斯亮蘭微板法測定每孔中細(xì)胞蛋白含量，采用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)試劑盒測定細(xì)胞ALP活性，定量測定兩組細(xì)胞中平均每毫克蛋白質(zhì)的ALP活性變化，比較兩組的差異。

　　1.7  茜素紅染色

　　誘導(dǎo)2周后，倒掉培養(yǎng)液，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3遍，茜素紅染色8 h，顯微鏡下觀察陽性結(jié)果。

　　1.8  免疫組織化學(xué)檢測Ⅰ型膠原和骨保護素的表達(dá) 
　　誘導(dǎo)2周后，細(xì)胞用40 g/L多聚甲醛固定20 min，進行Ⅰ型膠原和骨保護素免疫組織化學(xué)檢測，一抗為鼠抗人Ⅰ型膠原和骨保護素單克隆抗體，DAB顯色。

　　1.9  統(tǒng)計學(xué)處理

　　應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ±s)表示，以t檢驗進行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2  結(jié) 果

　　2.1  倒置相差顯微鏡所見的細(xì)胞形態(tài)的變化

　　用間斷負(fù)壓誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖速度略低于正常培養(yǎng)組細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)逐漸由梭型向多角型轉(zhuǎn)化，帶有數(shù)個突起，數(shù)目和形態(tài)不定，10-14 d細(xì)胞融合成單層，2周后逐漸形成多個散在的致密島狀結(jié)構(gòu)，而正常培養(yǎng)組細(xì)胞的形態(tài)大部分為梭型。誘導(dǎo)成功后，細(xì)胞1周左右傳1代，可穩(wěn)定傳10代。

　　2.2  ALP活性的測定

　　誘導(dǎo)2周后，間斷負(fù)壓誘導(dǎo)組的細(xì)胞ALP活性為(15.68±1.97)u/g，正常培養(yǎng)組為(6.34±1.21)u/g，t檢驗兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

　　2.3  茜素紅染色和Ⅰ型膠原及骨保護素的免疫組織化學(xué)檢測

　　負(fù)壓誘導(dǎo)2周后，茜素紅染色可見多個散在分布大小形態(tài)各