IL��9在變應(yīng)性鼻炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平

【摘要】  目的： 檢測(cè)變應(yīng)性鼻炎患者IL��9的表達(dá)水平,探討IL��9在變應(yīng)性鼻炎發(fā)生發(fā)展中的意義。方法： 收集49例變應(yīng)性鼻炎患者的外周血標(biāo)本，其中未治療組30例，臨床緩解組19例，另取30例健康志愿者的外周血標(biāo)本作為正常對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT�睵CR)檢測(cè)IL��9基因在外周血中的表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血漿IL��9含量。結(jié)果： 變應(yīng)性鼻炎未治療組外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL��9 mRNA表達(dá)水平及血漿IL��9含量明顯高于變應(yīng)性鼻炎臨床緩解組和正常對(duì)照組(P<0.05)，而變應(yīng)性鼻炎臨床緩解組與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。變應(yīng)性鼻炎未治療組IL��9 mRNA表達(dá)水平與臨床評(píng)分呈正相關(guān)。結(jié)論： 變應(yīng)性鼻炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL��9呈高表達(dá)。IL��9可能參與了變應(yīng)性鼻炎的病理過(guò)程，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

【關(guān)鍵詞】  變應(yīng)性鼻炎; 白細(xì)胞介素��9; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

　　Expression of IL��9 in peripheral blood mononuclear cellwith allergic rhinitis patients

　　JI Jun�瞲iang1, QIAN Wei1, ZOU Chen1, MA Yong�瞞ing1, LIN Zhi�瞦iang1, CHEN Jian�瞘uo1,

　　YANG Xian�瞶hi2, WANG Sheng�瞛un2高級(jí)工程師論文發(fā)表

　　(1.Department of Otolaryngology, the Affiliated People's Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002; 2.Department of Immunology, School of Medical Science and Laboratory Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013, China)

　　[Abstract] Objective: To establish a method of real�瞭ime fluorescence quantitative PCR for detecting IL��9 mRNA in human peripheral blood mononuclear cell (PBMC), and investigate the relationship between the expression of IL��9 and allergic rhinitis (AR). Methods: The mRNA levels of IL��9 in PBMC were determined by quantitative real�瞭ime PCR (QRT�睵CR), and detected the concentrations of IL��9 in plasma by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in 49 patients, including 30 untreated AR patients and 19 patients in recovering phase, and 30 healthy control volunteers. Results: IL��9 mRNA expression and IL��9 concentrations in the group of 30 AR patients without treatment were markedly higher than that in the groups of 19 AR patients in clinical remission and 30 healthy controls (P<0.05). but there were no significant differences between the groups of AR in clinical remission and normal control (P>0.05). Furthermore, the result of this study shows a positively correlated between IL��9 mRNA and clinical count in untreated AR patients. Conclusion: These results indicated that IL��9 was higher in AR patients without treatment, and suggesting that IL��9 might be involved in the pathological process of AR. The role of IL��9 in process of AR remains further investigation.

　　[Key words] allergic rhinitis; IL��9; real�瞭ime quantitative PCR

　　變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR) 又稱過(guò)敏性鼻炎，是耳鼻咽喉頭頸外科的常見病之一，其發(fā)病率有逐漸增高的趨勢(shì)[1]。IL��9可通過(guò)抑制嗜酸性粒細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)IL��5介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞前體的成熟來(lái)增加組織中的嗜酸性粒細(xì)胞[2-5];另外，IL��9能增加肥大細(xì)胞表面IgE高親和受體α(FcεR Iα)的表達(dá)和產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的量, 使得肥大細(xì)胞對(duì)變應(yīng)原做出反應(yīng)[5];并可刺激上皮細(xì)胞而導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生粘蛋白[3-6];同時(shí)，IL��9還可通過(guò)作用于平滑肌細(xì)胞來(lái)招募嗜酸性粒細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)IL��8的釋放來(lái)招募更多的中性粒細(xì)胞, 從而在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[7-9]。本研究通過(guò)檢測(cè)變應(yīng)性鼻炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中IL��9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平和外周血中IL��9蛋白的表達(dá)水平，以探討其在變應(yīng)性鼻炎中的表達(dá)變化及與變應(yīng)性鼻炎發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

　　1 材料與方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 臨床資料及標(biāo)本 AR患者未治療組為按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻喉科學(xué)分會(huì)2004年蘭州會(huì)議變應(yīng)性鼻炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，2008年12月至2009年9月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院就診的30例患者(男14例，女16例，年齡13～49歲，平均29歲)，均有AR典型癥狀，經(jīng)過(guò)粉塵螨、屋塵螨、豚草等20種常見陽(yáng)性變應(yīng)原血清特異性IgE檢測(cè)，至少一種為陽(yáng)性;臨床緩解組為AR發(fā)作期患者經(jīng)皮質(zhì)類固醇激素鼻噴劑雷諾考特、輔舒良、內(nèi)舒拿等藥物治療后(每日2次，每次1～2噴)臨床癥狀緩解1個(gè)月后復(fù)診，并經(jīng)療效評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)顯示為有效或顯效的19例患者(男9例，女10例, 年齡14～39歲，平均年齡24歲)。另選30例健康志愿者作為正常對(duì)照組(男14例，女16例, 年齡18～42歲，平均年齡27歲)，均無(wú)AR病史及哮喘、特應(yīng)性皮炎等其他變應(yīng)性疾病史，吸入組變應(yīng)原血清特異性IgE過(guò)篩試驗(yàn)檢測(cè)陰性。根據(jù)AR癥狀和體征評(píng)分方法篩選AR臨床緩解組患者。

　　療效判定標(biāo)準(zhǔn)：(治療前總分-治療后總分)/治療前總分×100%，≥66%為顯效，65%～26%為有效，≤25%為無(wú)效。

　　AR未治療組的30例患者經(jīng)治療后，其中20例為顯效，5例為有效，5例為無(wú)效，25例有效或顯效患者停藥1個(gè)月后有3例重新出現(xiàn)部分癥狀且評(píng)分低于顯效標(biāo)準(zhǔn)。我們?nèi)コ裏o(wú)效及癥狀復(fù)發(fā)的，取19例顯效和有效且停藥1個(gè)月癥狀未復(fù)發(fā)的為臨床緩解組。

　　1.1.2 主要試劑 人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)�洋生物制劑公�?，Trizol (Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司)，SYBR Premix Ex Taq、PMD18T�睞克隆試劑盒(TaKaRa公司),人IL��9 ELISA試劑盒(eBiosience公司)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)基因庫(kù)中目的基因序列，用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因檢測(cè)引物，由上海生物工程技術(shù)公司合成，序列見表1。表1 QRT�睵CR檢測(cè)引物序列及擴(kuò)增范圍

　　1.2.2 PBMC的分離 用肝素抗凝管收集健康志愿者、AR患者外周血2 ml，PBS以1∶1稀釋，混勻，沿管壁輕緩移入放有等體積Ficoll�卜河捌习�(人淋巴細(xì)胞分離液)離心管，1 500 r/min，15 min，離心半徑10 cm，吸取分層液的云霧層，PBS洗滌，RPMI��1640完全培養(yǎng)基(10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)重懸，計(jì)數(shù)，以1×106 個(gè)細(xì)胞/ml加1 ml Trizol，置-70 ℃冰箱凍存。

　　1.2.3 構(gòu)建目的基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 以上述制備的cDNA為模板，選取下列最佳的特異性擴(kuò)增條件：① 反應(yīng)體系：10×PCR 緩沖液2 μl，dNTP 1.6 μl，上下游引物各0.3 μl(10 pmol/L)，cDNA模板1.0 μl，Taq DNA聚合酶(5 U/μl) 0.2 μl，MgCl2(25 mmol/L) 0.8 μl，ddH2O 13.3 μl。② 反應(yīng)條件：變性，94 ℃ 30 s;退火,IL��9 58 ℃ (β�布�動(dòng)蛋白56 ℃) 30 s;延伸,72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。將目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物T�睞克隆，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，并送上海生物工程公司測(cè)序鑒定。所選陽(yáng)性質(zhì)粒倍比稀釋至108～104拷貝數(shù)/μl，備用。高級(jí)工程師論文發(fā)表

　　1.2.4 Rotor�睪ene 6000熒光定量PCR儀檢測(cè)目的基因表達(dá) 采用絕對(duì)定量法檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá)水平，SYBR Green Ⅰ法檢測(cè)熒光。所有樣本的檢測(cè)值都用β�布�動(dòng)蛋白進(jìn)行校準(zhǔn)。

　　1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件中Kruskal�瞁allis H檢驗(yàn)，3組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較利用Nemenyi法檢驗(yàn)，采用Spearman秩相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 IL��9和β�布�動(dòng)蛋白基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

　　以AR患者外周血cDNA為模板，PCR擴(kuò)增IL��9和β�布�動(dòng)蛋白基因，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖1。

　　1: DL2000標(biāo)準(zhǔn)參照物; 2: IL��9; 3: β�布�動(dòng)蛋白

　　圖1 AR患者外周血IL��9和β�布�動(dòng)蛋白

　　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

　　Fig 1 Identification of amplification of IL��9 and β�瞐ctin

　　by PCR in patients with AR

　　2.2 實(shí)時(shí)熒光定量�睵CR法建立β�布�動(dòng)蛋白和IL��9標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　以β�布�動(dòng)蛋白各梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，定量PCR擴(kuò)增β�布�動(dòng)蛋白，重復(fù)3次。圖2a為熔解曲線，未見雜峰，表明擴(kuò)增特異性較好;圖2b為QRT�睵CR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線，呈典型的S形，平臺(tái)期匯于一條直線上，指數(shù)區(qū)明顯，斜率大且固定(平行線);圖2c為定量結(jié)果，顯示標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增后的拷貝數(shù);圖2d中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為3.371;截距為40.703;相關(guān)系數(shù)為為0.99;擴(kuò)增效率0.98。以不同濃度梯度IL��9標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，QRT�睵CR擴(kuò)增IL��9，重復(fù)3次。圖3a為熔解曲線，峰尖在同一中軸上，表明擴(kuò)增特異性較好;圖3b為QRT�睵CR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線，平臺(tái)期集中同一直線上，指數(shù)區(qū)明顯，斜率固定;圖3c為定量結(jié)果，顯示與標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增后的拷貝數(shù);圖3d中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為3.513;截距為34.214;相關(guān)系數(shù)為0.999;擴(kuò)增效率為0.93。

　　2.3 AR患者未治療組、AR臨床緩解組與健康對(duì)照組IL��9 mRNA表達(dá)比較

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)3組IL��9 mRNA相對(duì)表達(dá)。結(jié)果顯示，AR未治療組、AR臨床緩解組和正常對(duì)照組之間IL��9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，AR 未治療組IL��9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于臨床緩解組和正常對(duì)照組(P<0.01);而臨床緩解組IL��9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。
2.4 AR 患者IL��9 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平與癥狀、體征記分相關(guān)性分析

　　結(jié)果表明，AR患者未治療組IL��9 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平與癥狀、體征記分呈正相關(guān)(n=30,r=0.602,P<0.001)。見圖5。

　　2.5 AR患者血漿IL��9表達(dá)水平

　　30例AR未治療患者、19例AR臨床緩解者和30例健康志愿者的血漿嚴(yán)格按IL��9 ELISA試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以箱圖表示(圖6)，AR未治療患者血漿IL��9的含量高于AR臨床緩解者和健康志愿者(P<0.05)，AR臨床緩解者和健康志愿者之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

　　3 討 論

　　在哮喘病患者體內(nèi)，IL��9作用于炎癥細(xì)胞和組織細(xì)胞，使淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞的量增多，提高了IgE的分泌量，增強(qiáng)了肥大細(xì)胞對(duì)變應(yīng)原的反應(yīng)，誘導(dǎo)黏蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)炎癥細(xì)胞分泌一些細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)。隨著研究的進(jìn)一步發(fā)展，還認(rèn)為IL��9在氣道高反應(yīng)性和哮喘表型中起了重要的作用[11, 12]。

　　本研究檢測(cè)了AR患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL��9 的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AR患者未治療組IL��9的表達(dá)水平高于AR患者臨床緩解組和健康對(duì)照組，而AR患者緩解組與健康對(duì)照組IL��9的表達(dá)水平無(wú)顯著性差異，提示AR患者體內(nèi)存在著IL��9的高表達(dá)，進(jìn)一步研究表明IL��9的表達(dá)水平與疾病的臨床評(píng)分呈正相關(guān)。提示了IL��9在AR的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用。高級(jí)工程師論文發(fā)表

　　Nicolaides等[12]的體外試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)IL��9的產(chǎn)生與Th9的數(shù)量密切相關(guān)，而IL��9又可促進(jìn)Th9細(xì)胞分泌IL��9，并具有維持Th9表型的功能，因而，有可能在變應(yīng)性疾病免疫內(nèi)環(huán)境IL��9促進(jìn)了Th9細(xì)胞的分化，而Th9的增多使得IL��9的分泌又增多，從而形成一條正反饋的效應(yīng)。這一機(jī)制的存在還有待于進(jìn)一步探討。

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