黃連活性成分的作用及機制研究進展

【摘要】  　　黃連及其活性成分特別是小檗堿在體外細胞研究中具有廣泛的藥理活性，文章綜述了近年來在抗腫瘤、抗糖尿病、抗菌抗炎、神經調節等幾大方面作用及機制研究進展，經過分析整理表明：進一步篩選小檗堿以外的黃連活性有效部位及如何提高小檗堿的生物利用度來充分發揮小檗堿的療效將是今后黃連研究的重點。

【關鍵詞】  黃連； 活性成分； 作用機制

　　Abstract：Coptidis Rhizoma and its active compounds especially berberine have a wide range of pharmacological activities in vitro cell study. This review summarizes several major effects  including anti-tumor,anti-diabetes,antibacteria and anti-inflammatory activities and neurological regulation of the constituents in Coptidis Rhizoma and its mechanisms . A further screening of the active compounds of Coptidis Rhizoma besides berberine and improvement of the bioavailability of berberine in order to give full effect in treating patients will be the focus of the study in the future.

　　Key words：Coptidis rhizoma;  Active ingrediens;  Mechanisms

    黃連Coptidis rhizoma為毛茛科植物，根莖為中藥要藥，被記載于各朝代重要醫藥典籍之中。中醫認為其具性寒、味苦，有清熱、燥濕、解毒、瀉火等功效。現代醫學證明，黃連的作用主要與其根莖所含的生物堿（約占根莖的4%～8%）有關，包括小檗堿（berberine）、黃連堿（coptisine），甲基黃連堿（worenine）、巴馬亭（palmatine）、藥根堿（jatrorrhizine）、表小檗堿（epiberberine）、木蘭花堿（mognoflorine），及中藥炮制過程中由小檗堿轉化而來的9-去甲小檗堿（berberrubine）等。王薇等［1］又首次從該植物中分離得到7個異喹啉類生物堿,分別鑒定為：8-oxyberberine(1) ，8-oxocoptisine(2)，8-oxo-epiberberine(3)，6-(［1，3］dioxolo［4，5-g］isoquinoline-5-carbonyl)-2，3-dime-thoxy-benzoic acid1 methylester(4)，corydaldine(5) ，noroxyhydrastineine(6)，6，7-methylenedioxy-1(2H)2isoquinolinone(7),7種成分活性需做進一步探討。
   
　　近年，國內外許多報道顯示，以小檗堿為代表的黃連生物堿在濃度為每毫升微克級水平時，對人及動物多種體外培養的胃、腸、膀胱、前列腺、肺、肝、子宮、皮膚、鼻咽等惡性腫瘤細胞生長有明顯的抑制作用，并促進細胞凋亡［2］。
    
　　從天然產物中尋找毒副作用小，安全有效的抗腫瘤藥物以及篩選抗腫瘤藥物有效部位為近年研究熱點，中藥黃連也是其中熱門之一。小檗堿為黃連主要生物堿，其藥效在抗炎抗菌以及體外抗腫瘤方面非常明顯，但小檗堿在體內研究中，口服吸收差,注射后迅速進入各器官與組織中，血藥濃度維持不久, 且靜脈注射或滴注可引起多種不良反應。改善小檗堿的生物利用度以及充分發揮小檗堿的藥效作用將是今后研究的重點。現將黃連活性成分作用及機制研究進展綜述如下。

　　1  抗腫瘤作用機制
   
　　黃連及其有效成分可通過細胞毒作用抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡、增強機體免疫功能、調節細胞信號傳導、抗氧化、誘導細胞分化等機制發揮抗腫瘤作用。

    Kohji Takara［3］發現黃連提取物對Hela細胞的生長有濃度依賴性抑制作用， 50μg/ml黃連提取物能夠顯著增加Hela細胞對紫杉醇的敏感性。黃連素在體外亦能以時間和劑量依賴的方式對Hela細胞產生細胞毒作用并誘導其凋亡。

　　1.1  誘導細胞凋亡細胞凋亡是多細胞生物體的重要的自穩機制之一,它的異常在腫瘤發病機制中具有重要作用。干預細胞凋亡的手段可望成為腫瘤治療的新策略。隨著研究的不斷深入,現已證實腫瘤細胞的迅速生長和擴散轉移與細胞凋亡過弱或過強有關,加強對藥物誘導腫瘤細胞凋亡及機制的研究,無疑會給腫瘤的防治提供新的思路和途徑。大量的研究表明,黃連及其小檗堿、生物堿等有抗腫瘤作用，而能夠誘導腫瘤細胞凋亡是其主要機制之一。
   
　　小檗堿在促人結腸癌SW620細胞凋亡的聯級反應中起作用，能抑制人結腸癌Lovo細胞增殖，誘導凋亡。誘導凋亡過程中，黃連總堿與小檗堿和陽性藥物比較，作用更為明顯，其作用顯然與黃連總堿中含有其他生物堿有關，提示有必要篩選其他有效成分［4，5］。

　　1.2  阻滯細胞周期小檗堿通過抑制周期關鍵蛋白Cyclin D1，阻滯PG細胞周期進展，使G0/G1期細胞增多，而S期和G2/M期細胞減少從而抑制肺癌PG細胞增殖［6］。不同濃度黃連和小檗堿作用細胞24 h后, G0/G1期細胞明顯下降,S期細胞明顯升高。兩者對CNE-2Z細胞周期阻滯在S期［7］。小檗堿對不同腫瘤細胞周期的阻滯不同,有待進一步研究。

　　1.3  酶學機制研究認為，小檗堿具有拓撲異構酶（TOPO）毒性，能夠通過抑制細胞周期蛋白，誘導細胞凋亡，抑制環氧酶-2（COX-2）等從而起到一定的藥效作用，COX-2在膽汁酸的致癌機制中發揮不可忽視的作用，小檗堿能抑制COX-2 mRNA、蛋白和PPARγmRNA的表達及PGE2合成。小檗堿抗結腸癌作用中可能與通過非PPARγ路徑調節COX-2表達有關［5，8，9］。
   
　　不同濃度小檗堿作用于肝癌細胞后細胞膜內的caspase-3蛋白和 mRNA的表達增加。在蛋白酶級聯切割活化過程中，caspase-3處于核心位置，不同的蛋白酶分別切割其酶原，使其激活，活化的caspase-3又進一步切割不同的底物，最終使細胞走向凋亡。小檗堿處理SW620細胞可活化capase-3和caspase-8，進而裂解多聚ADP核糖聚合酶（PARP），釋放細胞色素c，BID與抗凋亡因子CIAP1、Bcl-2、Bcl-xL的表達顯著減少，推測小檗堿在促SW620細胞凋亡的聯級反應中起作用，即通過激活JNK/p38途徑和誘導活性氧(ROS)產生而起作用［4］。

　　1.4  影響癌基因表達Bcl-2是凋亡控制基因，Bcl-2通過抑制誘導凋亡信號而在腫瘤發生中起作用。小檗堿能激活Bcl-2和抑制Bax和caspase-3的表達來抑制高糖高脂誘導的NIT21細胞凋亡［10］。黃連素可通過增強缺氧/ 復氧損傷中的心肌細胞的Bcl-2 蛋白的表達來抑制由缺氧/ 復氧所造成的心肌細胞的凋亡［11］。

　　1.5  影響信號通路在很多惡性腫瘤中均發現Cyclin D1過度表達，Cyclin D1已經被確認為一個癌基因。在正常人體組織中，Cyclin D1蛋白呈低水平表達，當Cyclin D1表達失控時，將引起細胞增殖周期失調，導致惡性腫瘤發生。小檗堿能抑制Cyclin D1表達，對Cyclin D1相關信號通路AP-1和Wnt的活性具有抑制作用，對異常激活的AP-1信號通路活性仍有顯著的抑制作用，能降低細胞內與Cyclin D1轉錄密切相關的AP-1轉錄因子組分c-Jun含量，并抑制Cyclin D1基因啟動子區與AP-1轉錄因子的結合，從而抑制Cyclin D1基因的轉錄水平，降低Cyclin D1的表達［6］。
   
　　尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑（u-PA）和基質金屬蛋白酶（MMPs）在癌癥轉移和血管發生中起很重要作用。抑制u-PA和MMPs后能夠抑制癌癥細胞的遷移和浸潤。 Yung Tsuan Ho［12］發現小檗堿能夠影響p-JNK, p-ERK, p-p38, IkappaK 和 NF-kappaB介導的信號通路來抑制人舌頭鱗狀癌細胞SCC-4中的MMP-2和MMP-9的作用；小檗堿還能夠通過對FAK, IKK和NF-kappaB介導的信號通路的作用降低SCC-4中u-PA，MMP-2和-9的表達，從而抑制SCC-4的遷移和浸潤。

　　1.6  免疫調節黃連提取物能抑制地塞米松誘導的小鼠胸腺細胞凋亡,對小鼠胸腺細胞具有一定的保護作用,可在一定程度上使其免受外源性糖皮質激素的損害,有提高免疫機能的作用。
   
　　大量研究結果表明,中藥能誘生和增強機體的免疫功能,通過增強機體免疫功能,誘生細胞因子如白介素-2（IL-2）, 干擾素（IFN）等，誘導淋巴細胞激活的殺傷細胞（LAKC）產生及自然殺傷細胞（NK）增殖,從而介導腫瘤細胞發生凋亡。北美黃連總提取物處理乳腺癌MCF-7雌激素受體陽性細胞后, IFN-β和TNF-α特別是IFN-β的mRNA表達量顯著提高。利用中和抗體抑制IFN-β增加，則明顯抑制黃連誘導的抗增殖效應，表明黃連的作用與IFN-β有關，同時說明該階段存在活化IFN-β的自分泌途徑［13］。

　　2  抗腫瘤體內研究
   
　　藥物藥理療效從體外轉入體內研究對于能否繼續用于臨床藥理研究將是一個關鍵。Ho YT等［14］利用小檗堿能夠體外誘導人舌頭鱗狀癌細胞凋亡，進一步作用于體內異種嫁接該瘤鼠類動物模型，其也能夠明顯抑制腫瘤的生長，表明小檗堿在臨床上能夠用來治療和預防舌頭瘤。小檗堿的體外作用活性已經得到公認，體外研究擴展到體內研究并應用于臨床抗腫瘤治療將有巨大的現實意義。

　　3  抗糖尿病作用機制
   
　　黃連根莖具有降低血糖的特性，長期以來，在傳統中醫處方中，用來治療糖尿病。已有動物實驗和臨床研究表明作為異喹啉類生物堿小檗堿能夠改善高血糖癥和改進胰島素耐受性［15～17］。

　　3.1  降糖并保護糖尿病大鼠周圍神經黃連生物堿特別是小檗堿通過降低糖尿病大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白比值和血清甘油三酯和膽固醇水平，提高糖尿病大鼠血漿胰島素水平。提高坐骨神經感覺和運動傳導速度，縮短動作電位潛伏期，調節自由基代謝紊亂，減輕脂質過氧化反應抑制多元醇代謝通路中活性和改善血液高粘狀態增加坐骨神經營養因子的表達而改善糖尿病大鼠周圍神經功能和結構，保護糖尿病周圍神經的病變［18］。
   
　　Jiyin Zhou［19］發現小檗堿能夠減少糖尿病小鼠的體重，肝重以及降低肝臟重量與體重的比例，能夠恢復糖尿病小鼠血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、載脂蛋白B等的量的增加；同時，高密度脂蛋白膽固醇、載脂蛋白AI等比正常水平的量減少。且能夠增加肝臟中PPARα/δ的表達和減少PPARγ的表達，改善糖尿病小鼠血液和肝臟糖脂代謝。

　　3.2  改善糖尿病性腎病變糖尿病性腎病變是一種糖尿病微血管并發癥，將導致終末期腎臟疾病。小檗堿能通過控制血糖，減少氧化應激和抑制多元醇活化途徑來改善糖尿病性腎病變小鼠的腎功能不全［20］。Weihua Liu認為小檗堿能通過P38MARK信號通路途徑抑制高糖處理過的腎小球細胞纖維蛋白和膠質原的結合作用，抑制P38MARK磷酸化或通過抗氧化作用影響信號通路，從而改善糖尿病性腎病變［21］。

　　3.3  防止內皮損傷和增強血管舒張 內皮損傷是導致肥胖、糖尿病、高血壓病、心血管等疾病病發的關鍵因素。小檗堿以濃度依賴性增強離體培養小鼠內皮血管細胞一氧化氮合酶（eNOS）的磷酸化，促進eNOS與熱休克蛋白90的聯合而增加一氧化氮的產生，且小檗堿還能減弱高糖誘導的活性氧的增加、細胞凋亡、核因子κ-B活性、粘連分子的表達等，從而抑制單核細胞對內皮的黏附。另外，在小鼠主動脈環，小檗堿引出內皮組織依賴的血管舒張和減輕高糖介導的內皮機能異常，通過AMPK信號級聯的激活作用介導防止內皮損傷和增強內皮組織依賴的血管舒張［22］。

　　3.4  減少細胞因子對胰島細胞的損傷效應Eun kyung Kim［23］研究表明，黃連提取物能夠抑制S-亞硝酸-N-乙酰青霉胺 誘導的細胞凋亡，預測黃連提取物的防御作用能夠對抗細胞因子誘導的胰島β-細胞壞死。利用黃連提取物處理體外培養胰島β-細胞，可明顯抑制白細胞介素-1β和γ干擾素誘導產生一氧化氮，其抑制iNOS基因表達的分子機制涉及抑制NF-κB的激活作用。與未受藥物刺激的細胞相比，細胞核中白細胞介素-1β和γ干擾素刺激RIN細胞使NF-κB結合活性增加以及p65亞基水平的增加，細胞質中的Iκ-B降解，可知其防御效應減少了NO產生和iNOS表達，從而減少細胞因子對胰島β細胞的損傷效應。

　　3.5  調控信號轉導通路小檗堿能促進3T3-L1細脂肪細胞分化和降低脂質積聚，其作用與通過促進3T3-L1中PPARα，PPARδ，PPARγ，CDK9，cyclin T1表達相關。RNAi下沉默CDK9基因，3T3-L1中PPARα，PPARδ，PPARγ，CDK9，cyclin T1表達受到抑制，小檗堿具有翻轉干擾效應并促進表達的作用，還可部分地通過影響CDK9參與脂肪細胞的分化功能，進而影響PPARs活性，使組織中糖脂代謝活動及相關酶、脂肪因子等恢復至接近常態，最終使2型糖尿病大鼠的糖脂代謝紊亂癥狀得以改善。因此，小檗堿的降糖調脂作用與其通過調控PPARs/P-TEFb信號轉導通路相關［24］。

　　4  抗菌抗炎作用及機制

    黃連是一種很好的清熱解毒消炎藥，具有廣譜抗生素的作用，對革蘭氏陽性和陰性細菌，原蟲及各型流感病毒，真菌類等均有一定的抑制作用。其體外抗菌活性比小檗堿好，小檗堿、黃連堿、巴馬亭、藥根堿等4種黃連生物堿均為黃連的抗菌活性成分,抑菌譜相同,但抑菌活性有較大差異，其中小檗堿的抑菌活性最大,黃連堿和巴馬亭次之,藥根堿最小；4種生物堿對革蘭氏陽性菌的抑制活性大于革蘭氏陰性菌和酵母菌，對耐藥金葡菌(MR)和金葡菌的抑菌能力基本相同，對耐藥金葡菌的耐藥性具有消除作用［25］。黃連總生物堿、小檗堿、黃連堿均具有防治應激性胃潰瘍作用，但黃連堿的作用強度要明顯強于黃連總生物堿和小檗堿。
   
　　利用不同濃度的小檗堿處理人腸上皮細胞Caco-2，通過測量上皮電位電阻觀察細胞緊密連接的完整性，并研究小檗堿對緊密連接和緊接合蛋白形態學方面作用，表明小檗堿能夠減少腸上皮細胞的滲透率，推測小檗堿有抗腹瀉活性［26］。Cheng ZF認為小檗堿能夠抑制甲狀腺機能亢進腹瀉小鼠胃腸多肽的提升和黏液分泌，從而起到止瀉作用［27］。

　　5  神經調節

    已有證據表明，中央多巴胺系統可以介導可卡因的行為強化效應，黃連及其小檗堿可通過調整中央多巴胺系統有效抑制可卡因的行為效應［28］。

　　6  結語與展望

    綜上所述，在黃連及其活性成分作用當中，小檗堿應用最廣，是黃連活性成分當中最有價值的單體，在抗糖尿病、抗腫瘤、抗菌抗炎等方面都可以發揮很好藥效，可見小檗堿是不可或缺的治病良藥。但小檗堿與大多數藥物一樣，具有肝臟的首過效應、存在溶解度低［29］(僅為0.2%)、機體吸收困難、難有效地被輸送至病變部位及細胞內等問題，導致其生物利用度低(一般為10%，<25%)，造成病人用藥次數頻繁，耐受性差，藥效差，大大限制其臨床應用［30，31］。小檗堿上市及正在研究的制劑不能完全地克服上述存在的問題。因此，研究改進小檗堿的生物利用度，突破體外研究進而轉入體內研究，充分發揮藥物小檗堿療效作用，為臨床疾病治療提供有力的支持將是我們今后要集中力量解決的重點難題。

    此外，在對乳腺癌MCF-7和結腸癌Lovo細胞的體外研究中發現，小檗堿對MCF-7和Lovo的生長抑制作用弱于黃連總提取物，提示可能存在小檗堿以外的抗腫瘤成分，因此繼續探尋篩選黃連其他抗腫瘤活性成分也有重要意義。

【參考文獻】
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　　［2］Youn MJ,So HS,Cho HJ, et al.Berberine a natural product combined with cisplatin enhanced apoptosis through a mitochondria/caspase-mediated pathway in HeLa cells［J］. Biol Pharm Bull,2008,31(5):789.

　　［3］Kohji Takara,Sayo Horibe,Yukihisa Obata et al.Effects of 19 Herbal Extracts on the Sensitivity to Paclitaxel or 5-Fluorouracil in Hela Cells［J］.Biol.Pharm.Bull,2005,28(1):138.

　　［4］Wen-Hsin Hsu,Yih-Shou Hsieh,Hsing-Chun Kuo et al.Berberine induces apoptosis in SW620 human colonic carcinoma cells through generation of reactive oxygen species and activation of JNK/p38 MAPK and Fals［J］.Arch Toxicol,2007,81:719.

　　［5］吳柯,周岐新.黃連生物堿抗結腸癌作用實驗及其分子機制研究［D］.碩士學位論文,重慶醫科大學,2007,5:5.